乌丹降脂方对脂肪肝大鼠脂肪肝细胞氧化损伤调节作用研究

陈翠英，邵明亮，杨　莉，叶立红，张　巍

(河北省石家庄市第五医院，河北 石家庄 050021)



乌丹降脂方对脂肪肝大鼠脂肪肝细胞氧化损伤调节作用研究

陈翠英，邵明亮，杨莉，叶立红，张巍

(河北省石家庄市第五医院，河北 石家庄 050021)

[摘要]目的观察乌丹降脂方对脂肪肝大鼠脂肪氧化损伤相关因子超氧化物歧化酶(SOD)、C反应蛋白(CRP)、活性氧(ROS)表达的影响。方法采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、多烯磷脂酰胆碱组、乌丹降脂组,正常组给予普通饲料喂养，其余组均采用高脂饲料喂养法复制大鼠脂肪肝模型。喂养6周后，乌丹降脂组给予乌丹降脂方0.07 g/(100 g·d)灌胃，多烯磷脂酰胆碱组给予多烯磷脂酰胆碱24.6 mg/(100 g·d)灌胃，模型组和正常组给予相同剂量生理盐水灌胃，连续6周。实验结束后采用ELISA法检测各组血清CRP含量及SOD活性，West-blot法检测肝组织中ROS表达情况，镜下观察肝组织病理变化。结果模型组血清 CRP含量及肝组织中ROS表达量均明显高于正常组(P均<0.05)，SOD活性明显低于正常组(P<0.05)；多烯磷脂酰胆碱组与乌丹降脂组血清CRP含量及肝组织中ROS表达量均明显低于模型组(P均<0.05)，SOD活性均明显高于模型组(P均<0.05)，且乌丹降脂组血清CRP含量及SOD活性改善情况均明显优于多烯磷脂酰胆碱组(P均<0.05)。结论乌丹降脂方通过调节肝细胞氧化损伤相关因子，改善肝细胞由于脂类代谢异常形成的过氧化损伤，促进肝细胞功能恢复，具备一定的改善脂肪变性效果。

[关键词]脂肪肝；中药；乌丹降脂方；过氧化损伤

随着人们生活方式和饮食结构的改变，脂肪肝的发病率逐年增高，据2014年最新统计人群平均发病率为15%，40～49岁男性发病率达28%，已成为威胁人类健康仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，其病理过程包括单纯性脂肪肝，进一步发展为脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化，甚至发展为肝癌[1]。中医临床辨证多将脂肪肝归为“胁痛”“积证”“痰证”等范畴，其病因与外邪、饮食、情志以及劳逸密切相关，病机则与肝郁、痰湿、脾虚、血瘀等密不可分[2]。 自拟乌丹降脂方即根据中医辨治原则所设，具有疏肝行气、燥湿化痰、疏肝解郁功效，但其作用机制尚不明确。本研究观察了乌丹降脂方对脂肪肝大鼠脂肪氧化损伤相关因子超氧化物歧化酶(SOD)、C反应蛋白(CRP)、活性氧(ROS)表达的影响，以期为脂肪肝的辨证施治提供理论依据。

1实验资料

1.1实验动物及分组选取SD大鼠40只，12周龄，体质量200 g，动物许可证号：1502095。采用随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、多烯磷脂酰胆碱组、乌丹降脂组，每组10只，适应性喂养1周。

1.2药物与试剂乌丹降脂方主要成分为丹参、泽泻、生山楂、何首乌、决明子、茵陈，均购自河北省乐仁堂医药有限公司，经有经验药师鉴定后使用。将原药按1∶1∶0.5∶1∶1.5∶0.5比例加双蒸水充分浸泡，在煎药机中熬制，配制成41.667 g/L的溶液备用，冀药制字：Z20051051。CRP、SOD ELISA试剂盒和兔抗鼠ROS抗体均购自博士德生物工程有限公司 。

1.3造模及给药方法正常组给予普通饲料喂养，其余组采用高脂饲料(基础饲料+2%胆固醇、10%猪油)喂养复制大鼠脂肪肝模型。喂养6周后，按照大鼠的给药剂量为成年人剂量6.3倍计算[3]，乌丹降脂组给予乌丹降脂方0.07 g/(100 g·d)灌胃，多烯磷脂酰胆碱组给予多烯磷脂酰胆碱24.6 mg/(100 g·d)灌胃，模型组和正常组给予相同剂量生理盐水灌胃，连续6周。

1.4观察指标

1.4.1血清CRP及SOD活性实验结束后，隔夜禁食,腹腔戊巴比妥麻醉,心脏采血,常规制备血清，按ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清CRP含量及SOD活性。

1.4.2肝组织中ROS表达情况采用West-blot法检测。处死大鼠后取出肝脏,取部分肝组织块于平皿中，加入PBS漂洗，切下约黄豆大小的肝组织放入手动匀浆器中，在冰上迅速碾磨直至呈现云雾状。加入组织裂解液约500 μL(裂解液∶PMSF=100∶1)，冰上作用20～30 min，吸取组织液到已高压灭菌的Ep管中，4 ℃离心，12 000 r/min×15 min。 取出EP管放在冰盒内,仔细吸取上清，取2 μL的上清用于蛋白浓度的测定，剩余上清按蛋白∶5×buffer=4∶1的比例加入5×buffer,煮沸10 min，瞬时离心，放入-20 ℃冰箱冻存备用。配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，加入蛋白样品，浓缩胶电泳恒流28 mA，约1 h。分离胶电泳15 V/cm(100/120 V),指示剂至分离胶底部，电泳完毕。裁下的凝胶泡入转膜缓冲液中，裁取同样大小的NC膜，从负极到正极按照纤维帕、3块滤纸、PAGE胶、膜、3块滤纸顺序用滴管边加转膜缓冲液逐层铺好，加好转膜夹，放入转膜槽中，100 V/200 mA ，转膜约2 h。将膜浸入封闭液中封闭1 h，加入1∶800用1×TBS稀释的二抗，37 ℃ 1 h。免疫显色。

1.4.3肝组织病理检查取甲醛固定肝组织，经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后进行显微镜下观察，判断各组脂肪肝程度。

1.5统计学方法应用SPSS 17.0统计软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组血清CRP含量及SOD活性模型组血清 CRP含量明显高于正常组(P<0.05)，SOD活性明显低于正常组(P<0.05)；多烯磷脂酰胆碱组与乌丹降脂组血清 CRP含量均明显低于模型组(P均<0.05)，SOD活性均明显高于模型组(P均<0.05)，且乌丹降脂组改善情况明显优于多烯磷脂酰胆碱组(P均<0.05)。见表1。

表1　各组血清CRP含量及SOD活性

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与多烯组比较，P<0.05。

2.2各组肝组织中ROS表达情况模型组ROS表达量明显高于正常组(P<0.05)，多烯磷脂酰胆碱组和乌丹降脂组ROS表达量均明显低于模型组(P均<0.05)。见图1。

图1　各组肝组织中ROS表达情况

2.3各组肝组织病理检查结果正常组肝组织结构正常；模型组肝细胞明显脂肪变性，多分布在核的周围。多烯磷脂酰胆碱组肝细胞肿胀，脂肪变性改善不明显。乌丹降脂组肝细胞脂肪变性程度明显改善。见图2～5。

图2　正常组肝组织病理表现(×100)

3讨论

目前研究发现，脂肪肝细胞存在明显的ROS含量升高，线粒体结构功能异常，而线粒体是细胞内合成ROS的重要场所[4]。在正常情况下，人体内ROS的产生和清除处于动态平衡，当机体受到某些因素刺激处于应激状态时，体内氧化与抗氧化作用失衡，细胞内ROS升高超过其清除能力，在体内蓄积引起生物大分子、细胞乃至组织损伤[5]。氧化应激产生的大量ROS不仅直接攻击细胞蛋白、脂质、核酸等组分，还可激活多种细胞内信号通路促进炎症反应，加速胞外基质分泌，诱导细胞凋亡，同时进一步加速ROS的合成[6]。作为与ROS产生距离最近的线粒体相关组分也成为ROS攻击的首要靶目标，进而诱导线粒体内部结构与功能异常，导致线粒体功能障碍，加速ROS的生成，导致恶性循环[7]。SOD、CRP是参与肝细胞急性损伤修复的重要成分，是否与ROS的诱导有关尚未可知。SOD是抗氧化酶类的代表，包括位于胞浆的CuZn-SOD、位于线粒体的Mn-SOD和分泌到细胞外的Fe-SOD 3种，能够清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化损伤，其活性水平代表细胞的抗氧化能力[8]。

图3　模型组肝组织病理表现(×100)

图4　多烯磷脂酰胆碱组肝组织病理表现(×100)

图5　乌丹降脂组肝组织病理表现(×100)

中医认为,脂肪肝的形成多与过食肥甘厚味，过度肥胖或感受湿热疫毒，或情志失调或久病体虚以及食积、气滞血瘀等有关。各种致病因素损伤脾胃,脾不化湿,郁久成痰,而痰湿之邪阻碍气机,使肝失疏泄,湿热内蕴，痰湿瘀阻互结，痹阻肝脏脉络而形成脂肪肝[9]。故治以疏肝行气、燥湿化痰为主，各医家均根据临床经验在辨证的基础上提出自己独特的治法以及相应的方药。乌丹降脂方中何首乌益肾填精,山楂消食化瘀降脂,泽泻健脾利湿，丹参活血化瘀，茵陈清热利湿疏肝，决明子清肝泻火，各方相互配伍具有降脂功效。药理学研究证实，何首乌所含二苯乙烯苷成分对用过氧化玉米油所致脂肪肝大鼠肝功能损害及肝中过氧化脂质含量升高有明显对抗作用，何首乌所含的多量磷脂酰胆碱尚能阻止TC在肝内沉积[10];丹参能降低TG，作用机制是促进脂肪在肝中的氧化作用，从而降低肝内脂质含量；决明子所含蛋白质和蒽酯苷均可降低高血脂症大鼠的TC、TG和LDL-C[11]；泽泻可选择性抑制外源性TG、TC的吸收，影响内源性TC代谢及抑制肝内TG的合成，通过影响与TC有关的酶及抑制肝内TG的合成而抗脂肪肝[12]。

本研究结果显示，模型组血清 CRP含量及肝组织中ROS表达量均明显高于正常组，SOD活性明显低于正常组；多烯磷脂酰胆碱组与乌丹降脂组血清 CRP含量及肝组织中ROS表达量均明显低于模型组，SOD活性均明显高于模型组，且乌丹降脂组血清CRP含量及SOD活性改善情况均明显优于多烯磷脂酰胆碱组。提示乌丹降脂方通过调节肝细胞氧化损伤相关因子，改善肝细胞由于脂类代谢异常形成的过氧化损伤，促进肝细胞功能恢复，具备一定的改善脂肪变性效果，但具体有效成分及其作用机制有待进一步研究。

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Study on the regulation of Wudanjiangzhi decoction on peroxidation damage in liver cells of the rats with liver fat

CHEN Cuiying, SHAO Mingliang, YANG Li, YE Lihong, ZHANG Wei

(The Fifth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050021,Hebei,China)

Abstract：Objective It is to observe the effect of Wudanjiangzhi decoction on correlated factors of peroxidation injury SOD, CRP ROS in fatty liver rats. Methods The rats were randomly divided into 4 groups by random number method: normal group, model group, polyene phosphatidyl choline group, Wudan jiangzhi group.The rats in normal group were fed with normal diet, the rats in the other groups were fed with high fat diet to establish fatty liver models. After feeding for 6 weeks, Wudanjiangzhi group was given 0.07 g/(100 g·d) by lavage, polyene phosphatidyl choline group was given polyene phosphatidyl choline 24.6 mg/(100 g·d) by lavage, the normal group and model group were given the same dosage of normal saline. All the groups were treated for 6 weeks. After treatment, serum CRP content and SOD activity were detected by ELISA, the expression of ROS was detected by West-blot method, the pathological changes of liver tissue was observed under microscope. Results The content of CRP and expression of ROS were higher while activity of SOD was lower in model group than that in normal group (P<0.05).The content of CRP and expression of ROS were lower while activity of SOD was higher in polyene phosphatidyl choline group, Wudan jiangzhi groupmodel group than that in normal group (P<0.05), and the improvements of CRP and SOD in Wudanjiangzhi group were better than those in polyene phosphatidyl choline group. Conclusion Wudanjiangzhi could improve liver cell peroxidation damage due to the formation of abnormal lipid metabolism by regulating liver mitochondrial function, reduce inflammatory mediators, promote the recovery of liver function, it have a certain therapeutic effect.

Key words:fatty liver; Wudanjiangzhi decoction; peroxidation damage

[作者简介]陈翠英，女，主任医师，主要从事代谢性肝病机制研究。 [通信作者]张巍，E-mail：wygbyjs@163.com

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.20.005

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)20-2180-04

[收稿日期]2015-12-03