一株野鸟源H3N8亚型流感病毒分离株的全基因组序列分析

兰 玲，王 涛，王 晶，程子兵，邓国华，陈化兰

（1. 新疆动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐，830011；2. 塔城市动物疫控中心，新疆塔城 834300；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001）



一株野鸟源H3N8亚型流感病毒分离株的全基因组序列分析

兰 玲1，王 涛1，王 晶3，程子兵2，邓国华3，陈化兰3

（1. 新疆动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐，830011；2. 塔城市动物疫控中心，新疆塔城 834300；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001）

摘 要：本研究对2014年从新疆额敏县分离到的一株野鸟源H3N8亚型流感病毒A/wild bird/Xinjiang/S3525/2014 （H3N8）进行了全基因序列和进化分析。序列分析显示，HA裂解位点序列为339PEKQTR-GLFG348，为典型的低致病性禽流感病毒特征，NA基因具有6个潜在的糖基化位点，与病毒株A/mallard/Czech Republic/14333-1K/2011（H3N8）核苷酸高度同源（97.7%）。该毒株的内部基因来源较复杂，其PB1、NP基因分别与A/ruddy shell duck/Mongolia/921C2/2009（H7N1）和A/wild duck /Korea /MHC39-26/2011（H7N9）的同源性最高，其余内部基因与H2、H3、H6、H7等亚型禽流感病毒分离株同源性最高，呈现明显的异源性。除PB2基因外，其余基因片段均来源于野鸟源禽流感病毒。

关键词：流感病毒；H3N8亚型；基因组分析

野鸟作为禽流感病毒（AIV）的天然宿主、携带者及传播者，已从中分离到H1～H16、N1～N9[1]多种亚型病毒。在野鸟中分离到的H3亚型病毒并不少见。2008年郭亮等[2]在三江国家级自然保护区的野鸟中分离到H3N8亚型流感病毒，2006—2010年从洞庭湖采集的47只野鸟中也分离到一株H3亚型流感病毒[3]。H3亚型流感病毒具有较广泛的感染宿主谱，能够感染禽类、哺乳动物[4-5]，且是人流感病毒的一个主要亚型，还可引起马流感，偶尔暴发的猪流感也与H3亚型有紧密联系[6]，因此加强对H3亚型流感病毒的研究有着重要意义。

本研究在额敏县额玛勒郭罗蒙古族乡水库采集野禽粪便180份，其中在1份粪便样品中分离到一株野鸟源H3N8亚型流感病毒，并对其进行了全基因组测序，从分子生物学水平分析其来源，旨在为该地区禽流感病毒的变异监测和分子流行病学分析提供必要的科学基础。

1　材料和方法

1.1病毒株及实验动物

A/wild bird/ Xinjiang/S3525/2014（H3N8）病毒分离株，来自2014年新疆额敏县水库，由国家禽流感参考实验室分离保存，以下简称XJ/525/14。10日龄SPF鸡胚，购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2主要试剂

RNA提取试剂Trizol LS，购自Invitrogen公司；DNA聚合酶和Marker 2000，均购自TakaRa有限公司；胶回收试剂盒，购自上海华舜生物工程公司；反转录酶（MLV）试剂盒，购自Invitrogen公司。

1.3病毒的纯化增殖

将分离株按10倍倍比稀释，然后将各稀释度经尿囊腔接种2枚10日龄SPF鸡胚，37 ℃培养，48 h后收集尿囊液测其血凝价，收取有血凝价且最高稀释度的尿囊液，用10日龄SPF鸡胚纯化3代，进行病毒扩增后-80 ℃保存。

1.4全基因组序列分析

1.4.1RNA提取与PCR扩增。采用LS TRIzol试剂盒，按说明书进行病毒RNA提取；根据Gen-Bank中H3亚型流感病毒各基因片段序列选择同源性最高的区域，设计PCR引物进行目的片段的扩增，扩增产物按照胶回收试剂盒说明书进行纯化。

1.4.2序列测定与分析。用BigDye Terminator测序试剂盒，按照说明书进行测序产物纯化，然后在ABI测序仪中测序；利用DNAStar软件中Seqman拼接序列，应用MegAlign（By Clustal V Method）进行同源性比较和进化分析，用MEGA5（construct/ Test maximum likelihood Tree）绘制各基因片段的进化树。

2　遗传及进化分析结果

对该野鸟源H3N8亚型AIV进行全基因组遗传演化分析发现，与此毒株表面基因同源性较高的均为野鸟源毒株，且均来源于不同国家。其内部基因除PB2基因外，全部来源于蒙古国、美国等国家的野鸟源AIV，表明野鸟可通过迁徙携带并传播该病毒[8]。而PB2基因与贵州鸭源PB2基因同源性最高，说明野鸟源AIV有可能在与水禽共同的生活环境中，同水禽发生了内部基因交换。将A/wild bird/XinJiang/S3525/2014 （H3N8）的8个基因节段分别克隆测序，列出与GenBank中核苷酸序列同源性最高的毒株，见表1。

表1　XJ/525/14分离株的各基因片段BLAST分析结果

2.1HA基因序列及进化分析。XJ/525/14分离株的HA基因全长1701bp，编码566个氨基酸，HA裂解位点氨基酸序列均为339PSIEPK↓GLF347，具有低致病性AIV（LPAIV）特征。潜在糖基化位点分别为24NST26、38NGT40、54NAT56、181NVT183，301NGS303，499NGT501。HA可能的受体结合位点分别为114Y、169W、199H、206E、210L、211Y、242Q、244G，表明其具有禽源毒株特征。XJ/525/14HA基因属于欧亚分支（图1），与A/gadwall/Altai/1324/2007（H3N8）同源性最高（98.1%），提示可能具有同一来源。与此毒株HA基因同源性较高的还有蒙古国的野鸟源毒株。

2.2NA基因序列及进化分析。XJ/525/14病毒株的NA基因全长1413 bp，共编码470个氨基酸，无颈部缺失，属于欧亚分支，与2013年感染人的H10N8的NA基因不处于同一分支，亲缘关系较远。序列分析结果显示，NA基因有6个潜在的糖基化位点，分别位于46NET48、54NET56、84NNT86、144NGT146、293NWT295、398NWS400，与病毒株A/mallard/Czech Republic/14333-1K/2011（H3N8）核苷酸高度同源（97.7%）。与其处在同一分支的同源性较高的片段并不仅局限于H3亚型的AIV，还有H12、H6、H1亚型AIV的N8NA基因。

图1　XJ/525/14病毒分离株的表面基因进化树

2.3内部基因序列及进化分析。内部基因序列及进化分析显示，病毒分离株XJ/525/14的内部基因均属于欧亚系，其中NP基因与A/wild duck /Korea /MHC39-26/2011（H7N9）的同源性最高（99.4%）；PB1基因与A/ruddy shelduck/Mongolia/921C2/2009（H7N1）同源性为98.4%；NS基因与A/common shelduck/Mongolia/2157/2011（H3N3）、PA基因与A/Northern Shoveler/Georgia/1/2010（H2N3）均高度同源；M基因与A/European teal/Chany/63/2011（H3N8）的同源性为99.7%。这都表明此病毒与其它亚型病毒发生了重组。这些基因片段均来源于野鸟，表明与野鸟毒株有着共同的祖先。特别是PB2基因与A/duck/Guizhou/1560/2007（H6N8）的同源性最高（98.9%），表明其PB2基因已有可能通过与水禽共同生活，与水禽发生了内部基因交换。序列分析显示，XJ/525/14病毒株内部基因PB2（E158G、E627K、D701N）、PB1（K198I、M317K、Y436H）、PA（T97I、T515A）以及M2（S31N）、NS（D92E）基因片段未发生使其毒力增强的相关突变[7]，但值得注意的是NS基因片段中出现的149为氨基酸的突变，即V149A，能否使其毒力增强，还有待进一步实验验证。H3N8分离株的内部基因片段与H2、H3、H6、H7等多种亚型的LPAIV同源性较高，表明该毒株为不同亚型AIV的重组毒株。不同亚型LPAIV毒株基因片段的交换和重组现象非常普遍，LPAIV通过在宿主体内与高致病性禽流感病毒（HPAIV）发生基因重排，有可能产生新的HPAIV[9]，因此LPAIV的危害不容小觑。

3　讨论

研究表明在与野鸟密切接触的水禽中，H3亚型AIV普遍存在，且其多个基因片段与野鸟源AIV同源性较高[10]。在野鸟体内，H3亚型是普遍存在的流感亚型，其基因节段可为不同时期、不同地区、不同亚型的流感病毒重组提供条件，导致新的流感暴发。新疆塔城地区地处全球候鸟中东非-西亚迁徙路线，额敏河横贯塔城地区额敏县全境，是塔额盆地最大的水系。额敏河流域的野生禽类约有40余种，因此在该地开展野鸟禽流感监测，便于帮助了解家禽AIV的感染情况，对禽流感的早期预警及综合防控具有重要意义。

参考文献：

[1] Webster R G，Bean W J，Gorman O T，et al. Evolution and ecology of infl uenza A viruses[J]. Microbiol Rev. 1992，56（1）：152-179.

[2] 郭亮，柴洪亮，张兰兰，等. 野鸭源H3N8亚型禽流感病毒NS基因的分子克隆及序列分析[J]. 东北林业大学学报，2009 （7）：115-118.

[3] 范仲鑫，刘道新，唐小明，等. 野生鸟类禽流感病毒感染情况的调查[J]. 中国预防兽医学报，2012（2）：96-99.

[4] Callan R J，Early G，Kida H，et al. The appearance of H3 infl uenza viruses in seals[J]. J Gen Virol，1995，76（Pt 1）：199-203.

[5] Said A W，Usui T，Shinya K，et al. A sero-survey of subtype H3 influenza A virus infection in dogs and cats in Japan[J]. J Vet Med Sci， 2011，73（4）：541-544.

[6] Bean W J，Schell M，Katz J，et al. Evolution of the H3 infl uenza virus hemagglutinin from human and nonhuman hosts[J]. J Virol， 1992，66（2）：1129-1138.

[7] Zhao G，Lu X，Gu X，et al. Molecular evolution of the H6 subtype infl uenza A viruses from poultry in eastern China from 2002 to 2010[J]. Virol J， 2011，8：470.

[8] 李井春，赵凤菊，于学武，等. 野鸟在禽流感流行病学中的作用研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2010（7）：178-180.

[9] 王金良，李旭勇，范俊，等. H9N2亚型禽流感病毒的序列分析及对哺乳动物致病力研究[J]. 中国预防兽医学报，2013 （8）：663-665.

[10] Deng G，Tan D，Shi J，et al. Complex reassortment of multiple subtypes of avian infl uenza viruses in domestic ducks at the Dongting Lake region of China[J]. J Virol，2013.

（责任编辑：朱迪国）

编者按 ：为提高动物卫生执法人员动物卫生法学理论水平和执法办案能力，贯彻《全国官方兽医培训规划（2010—2014年）》提出的“创新方法，形式多样”的培训原则，本刊在“培训园地”栏目开设了“习题与答案”，特委托青岛东方动物卫生法学研究咨询中心就动物卫生法学理论知识及执法实践中的热点问题编写成习题，并以当期刊问题下期刊答案的形式，供执法人员自学。执法人员可以自选习题进行作答，凡将答案反馈的，《中国动物检疫》编辑部和青岛东方动物卫生法学研究咨询中心共同出具学时证明（请将答案邮寄至《中国动物检疫》编辑部）。

【第三期习题与答案】

1. 简述《行政处罚决定书》中的处罚依据和处罚决定内容。（本习题0.4学时）

答：《行政处罚决定书》中的处罚依据是指作出处罚决定的法律依据，即对违法行为进行制裁的法律依据。作出处罚决定所依据的法律、法规、规章应当写明全称，列明适用的条、款、项、目并引用法条原文。《行政处罚决定书》中的处罚决定内容是指给予当事人的法律责任种类。对于给予没收违法所得和罚款的处罚种类还应当写明数额，并使用阿拉伯数字表示。处罚决定内容中给予当事人的法律责任种类，必须与所适用的处罚依据相对应，适用的处罚依据中未设定其他处罚种类的，执法人员不得随意增加。如，《动物防疫法》第七十八条对经营未附检疫证明的违法行为，只设定了一个处罚种类，即罚款，执法人员在适用该条对该行为实施处罚时，不得增加“警告”或“没收违法所得”等任何处罚种类的内容。

2. 简述《行政处罚决定书》中写书救济途径和期限时需要注意的三个问题。（本习题0.6学时）

答：在制作《行政处罚决定书》时，写书救济途径和期限需要注意以下三个问题。一是当事人对动物卫生监督机构作出的行政处罚决定不服的，应当告知当事人向该动物卫生监督机构的主管部门进行复议，即同级人民政府兽医主管部门，书写时，应当明确兽医主管部门的具体称谓。二是必须要明确告知救济期限。《行政复议法》对当事人的复议时效作出了严格的规定，即复议时效为60天。需要特别说明的是，新修订的《行政诉讼法》自2015年5月1日起施行，该法将当事人的诉讼时效由“三个月改为了六个月”，制作《行政处罚决定书》时，要将文书中印刷的当事人诉讼时效由“三个月改为六个月”。三是告知当事人向有管辖权的人民法院提起诉讼。根据《行政诉讼法》和最高人民法院相关司法解释的规定，一般情况下，当事人对动物卫生行政主体作出的行政处罚决定不服提起诉讼的，由基层人民法院管辖，即由作出行政处罚决定的兽医主管部门或动物卫生监督机构所在地的县级人民法院管辖。目前，最高人民法院正在全国范围内开展行政案件相对集中管辖试点工作，兽医主管部门和动物卫生监督机构应当加强与所在地法院的沟通，如果所在地已经实施行政案件集中管辖试点的，应当明确告知当事人向集中管辖法院提起诉讼。

【本期习题】

（习题的参考材料见本期“培训园地”文章）

1. 简述当场收缴罚款的情形及程序。（本习题0.5学时）

2. 简述申请人民法院强制执行的条件、期间和应当提供的材料。（本习题0.5学时）

答疑解惑

编者按：为提高动物卫生执法人员动物卫生法学理论水平和执法办案能力，本刊在“培训园地”栏目开设 了“答疑解惑”板块，选取读者来信中对动物卫生监督执法具有指导意义的问题，委托青岛东方动物卫生法学研究咨询中心解答。每期刊登6个问题，当期解答3个，其余的下期解答。读者咨询问题或投稿解答的答案正确的，每个问题计0.1培训学时（须于次月底前投稿，如第7期杂志刊登的问题，8月30日前投稿解答）。读者咨询问题或者投稿解答问题的，请将答案或所咨询问题邮寄至《中国动物检疫》编辑部。

【问与答】1

1.执业兽医可以依托兽药经营企业注册吗？

答：根据《执业兽医管理办法》第四十条的规定，执业兽医不得依托兽药经营企业注册或者备案。对此，《农业部办公厅关于执业兽医注册等有关问题的函》（农办医函〔2014〕19号）进一步予以明确。

2.执业助理兽医师可以在执业兽医师的指导下协助开展动物胸腔手术吗？

答：可以。根据《执业兽医管理办法》第二十三条的规定，执业助理兽医师可以在执业兽医师的指导下协助开展动物颅腔、胸腔和腹腔手术等活动。对此，《农业部办公厅关于执业兽医注册等有关问题的函》（农办医函〔2014〕19号）进一步予以明确。

3.持有《兽药经营许可证》经营者的哪些违法行为，属于《兽药管理条例》第五十六条规定的“情节严重”的情形？

答：根据2015年农业部公告第2071号的规定，兽药经营者未审核并保存兽药批准证明文件材料，经营假兽药货值金额2万元以上的违法行为，属于《兽药管理条例》第五十六条规定的“情节严重”的情形。

【请解答】

1.《动物防疫法》法律责任章节中，有七个法条规定了“责令改正”，这里规定的“责令改正”是行政处罚种类吗？

2.在畜禽专业合作社注册的执业兽医，可以对外开展兽医执业活动吗？

3.对销售非生猪定点屠宰厂（场）生猪产品的违法行为，由哪个部门进行监管？

1 2016年第3期解答的问题：发布兽药广告不得含有哪些内容？2.在屠宰加工环节，兽医主管部门可以对销售含有“瘦肉精”动物产品的违法行为，适用《兽药管理条例》实施行政处罚吗？3.个人无证经营兽药的，可以按照《兽药管理条例》的规定实施行政处罚吗？具体内容见《中国动物检疫》2016年第3期第92页。

北京市开展亚洲I型口蹄疫病毒材料专项检查

北京动物卫生监督网按照北京市农业局《关于开展亚洲I型口蹄疫病毒材料调查和处置有关工作的通知》，北京市针对兽医实验室及有关单位开展了亚洲I型口蹄疫病毒材料专项排查工作。执法人员重点检查了亚洲I型口蹄疫病毒材料的保藏情况并传达了有关文件精神，同时对菌（毒）种和易燃易爆化学品的保藏和使用管理进行检查，要求各兽医实验室及有关单位切实加强生物安全管理，科学、规范开展菌（毒）种研究。

中图分类号：S855.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）04-0077-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.04.025

基金项目：国家科技攻关项目（KJYJ-2013-01-01）

通信作者：邓国华

Sequence Analysis of a H3N8 Subtype Infl uenza Virus Isolated from Wild Bird

Lan Ling1，Wang Tao1，Wang Jing3，Cheng Zibing2，Deng Guohua3，Chen Hualan3
（1.Xinjiang Animal Health Inspection Institution，Urumqi，Xinjiang 830011；2.Tacheng Animal Disease Prevention and Control Center，Tacheng，Xinjiang 834300；3. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Animal Infl uenza Key Laboratory of the Ministry of Agriculture/Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Science，Harbin，Heilongjiang 150001）

Abstract：To study the biological characteristics of a H3N8 subtype infl uenza virus（AIV），an AIV A/wild bird/ Xinjiang /S3525/2014（H3N8）was isolated from wild bird in Xinjiang and subjected to sequencing analysis. The sequencing results showed that there was a HA cleavage site of 339PEKQTR-GLFG 348 in the isolate ，which was a typical characteristic structure of low pathogenic AIV，and six potential glycosylation sites in the NA gene，and the nucleotide sequence was highly homologous（97.7%）with virus strain A/ mallard/Czech Republic/14333-1K/2011（H3N8）. The PB1 and NP genes were highly homologous to A/ruddy shell duck/Mongolia/921C2/2009（H7N1）and A/wild duck/Korea/MHC39-26/2011（H7N9）respectively. The rest of the internal genes were highly homologous to H2、H3、H6 and H7 subtypes of AIV， showing signifi cant heterogeneity. Except PB2 gene，the remaining gene segments were derived from AIV of wild birds.

Key words：infl uenza virus subtype；H3N8 subtype；genome analysis