表达人WDR70基因的质粒构建及鉴定* 1

杨　潮，叶　茂，陈　慧

(1.赣南师范学院 a.生命与环境科学学院;b.国家脐橙工程中心，江西 赣州　341000;2.湖南大学 生物学院，长沙　410082)



表达人WDR70基因的质粒构建及鉴定* 1

杨潮1a,1b，叶茂2，陈慧1a,1b

(1.赣南师范学院 a.生命与环境科学学院;b.国家脐橙工程中心，江西 赣州341000;2.湖南大学 生物学院，长沙410082)

摘要：WD重复蛋白(WD repeat protein)家族是一类含有多个保守WD基序的蛋白.该家族蛋白广泛存在于真核细胞中，参与细胞发育、增殖和凋亡等生理过程.WDR70隶属于WD重复蛋白家族，其生物学功能目前仍不清楚.本文以人cDNA为模板扩增WDR70基因；然后以pTag2b为载体，通过同源重组构建重组质粒并进行测序.同时将质粒转染至人肺癌细胞株A549中，进行WDR70蛋白的表达分析.结果显示该重组质粒在A549细胞中能有效表达.质粒pTag2B-WDR70的成功构建为进一步研究WDR70相关生物学功能提供实验基础.

关键词：WDR70;WD重复蛋白;cDNA克隆

WD重复蛋白(WD repeat protein)家族是一类含有多个保守WD基序的蛋白.WD基序又被称为Trp-ASP或WD40，每个WD基序由40个左右氨基酸残基组成，具有保守的GH和WD序列，这些特殊的序列结构可以介导蛋白质的相互作用[1-3].WD重复家族蛋白广泛存在于真核细胞中，参与信号转导、转录调节、细胞发育、增殖和凋亡等生理过程[4-5].目前已发现多种WD家族蛋白的突变能够导致人类的多种疾病产生，如癌症的发生[6-7]、Allgrove综合征发病[8]等.WDR70隶属于WD重复蛋白家族，曾有研究通过原位杂交实验发现WDR70在8.5 d时期的小鼠胚胎中无表达，9.5 d和10.5 d时期的胚胎脑部有特异性表达，预示WDR70基因在胚胎时期对于脑部的发育有重要影响[9].目前，该基因的生物学功能尚不清楚.本文以人cDNA为模板扩增WDR70基因；然后以pTag2b为载体，通过同源重组构建重组质粒，为开展WDR70功能研究工作提供实验材料，同时为我们了解该基因在人的生理和病理过程中的功能作用奠定基础.

1实验材料和方法

1.1实验材料

质粒pTag2b和A549细胞为本实验室保存.

HindIII限制性内切酶(日本Takara)、T4 DNA连接酶(日本Takara)、KOD高保真聚合酶(日本Takara)、氨苄青霉素(北京鼎国)、Escherichia coli DH5α感受态细胞(天根).QIAprep® Spin Miniprep Kit (250)试剂盒(德国Qiagen)、胶回收试剂盒(天根)、总RNA提取试剂盒(天根)、反转录试剂盒(日本TOYOBO)、ClonExpress TM重组克隆试剂盒，(南京Vazyme).DMEM培养基(上海Gibco)、磷酸盐缓冲液DPBS(美国INVIGEN)、0.25% Trypsin-EDTA胰酶细胞消化液(美国INVIGEN)、磷酸盐缓冲液DPBS(不含钙、镁)(美国Hyclone).蛋白酶体抑制剂MG132(碧云天)、细胞蛋白裂解液M-PER(碧云天)、蛋白酶抑制剂HALT protease inhibitor cocktail(北京鼎国)、丽春红染色液(碧云天)、脱脂奶粉(Sigma)、NC膜(0.45 um)(碧云天)、Mini Trans-Blot Filter Paper(Bio-rad)、HRP goat-anti-mouse IgG(Santa CruZ)、HRP goat-anti-rabbit IgG(Santa CruZ)、Anti- WDR70 antibody(WB)(Abgent)、Anti-β-actin antibody(Abmart).

1.2实验方法

1.2.1人cDNA的制备

收集对数生长期的人源细胞293T样本，使用Trizol提取总RNA 后依照TOYOBO公司逆转录试剂盒的操作方法进行相应逆转录实验，获得人源的cDNA.

1.2.2重组人WDR70基因的质粒构建

本文采用南京Vazyme公司的ClonExpressTM快速克隆技术，该技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点.我们针对WDR70的cDNA序列和质粒pTag2b的酶切位点设计合适的PCR引物序列并合成(见表1)，以人源的cDNA为模板，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶跑胶鉴定PCR产物长度.

表1　WDR70引物序列

以质粒人cDNA为模板， 以表1中引物扩增全长人WDR70的cDNA序列， 将PCR片段经酶切、纯化后与质粒pTag2b按照一定比例进行连接，连接产物经转化和小提后进行Hind III酶切鉴定，同时将重组后的质粒进行测序分析(上海生工)证实其正确性.

图1　pTag2B-WDR70质粒图谱

图2　WDR70在染色体上的定位示意图

图3　WDR70蛋白结构域示意图

图4　WDR70基因PCR结果

1.2.3细胞培养及转染

A549细胞所用培养基为包含1%的青霉素和链霉素、10%胎牛血清的F-12K 细胞培养基，置于5% CO237 ℃条件下的细胞培养箱中培养，细胞在培养皿中铺满率达80-90%进行细胞传代.当细胞铺满率达70%后进行细胞转染实验，将质粒pTag2b和人WDR70基因的重组质粒pTag2b-WDR70分别与脂质体孵育后，转染进A549细胞中，培养48 h收集相应的细胞样本进行后续实验.

1.2.4蛋白免疫印迹实验

收集好的细胞样本经蛋白裂解液处理后获得细胞蛋白样本.将变性后的蛋白样品进行10% SDS-PAGE跑胶、转膜等步骤后，用5% 的牛奶对膜进行封闭1 h，再使用特异性识别WDR70蛋白一抗与膜 4 ℃杂交过夜，然后用兔源二抗与膜室温封闭1 h，最后用ECL发光液检测实验结果.

2结果与分析

2.1WDR70基因PCR扩增

人WDR70基因位于5号染色体短臂13.2区大约70 kb范围内(见图2)，编码区序列长为1965 bp，WDR70编码的蛋白质含655个氨基酸，理论分子量为64×103u，含有起始密码子ATG和终止密码子TGA.

WDR70在真核生物中是一种非常保守的蛋白，WDR70的编码区与小鼠同源基因的编码区序列一致性为86%，氨基酸序列的一致性为89%.在Human Ptortein Reference Database网站对WDR70氨基酸序列分析，发现WDR70蛋白中含有6个WD重复结构域(见图3).

本实验设计合适的引物(见表1)，以人cDNA为模板，经PCR扩增得到目的基因的编码区序列，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图4所示.从图4能看出，3组PCR产物均在目标位置出现特异性条带，片段大小在2kb附近，与预期一致.

2.2重组质粒pTag2b-WDR70的酶切鉴定

用胶回收试剂盒回收PCR产物，与载体pTag2b在催化下同源重组得到pTag2b-WDR70重组载体，并转化至DH5ɑ大肠杆菌感受态细胞，挑选单克隆菌落并摇菌，提取质粒.对质粒进行单酶切处理，然后跑胶鉴定酶切产物(图5,WDR70基因条带,空载体pTag2b，1-4号为重组载体pTag2b-WDR70).

由图5可知pTag2B-WDR70经过Hind III酶单酶切后，得到两组条带，上面的一组条带来自pTag2B载体，下面一组为WDR70目的基因，片段大小为2.0 kb，而1号空载体作为阴性对照，其泳道内2.0 kb处无条带，实验结果与预期相符.其中2、3、4、5号泳道出现3条条带，可能是酶切不完全导致.重组质粒pTag2B-WDR70进行测序分析(上海生工)证实与WDR70 CDS序列一致.

2.3WDR70表达分析

图5　WDR70重组载体的酶切鉴定

图6　A549细胞后蛋白表达检测

将重组载体质粒pTag2b -WDR70与空载体质粒pTag2b分别转染进A549细胞中，培养48 h后收集细胞样本.利用蛋白免疫印迹实验考察WDR70蛋白的表达情况(如图6所示,蛋白免疫印迹实验考察分别转染了pTag2b空质粒和pTag2b -WDR70质粒的A549细胞中WDR70蛋白表达水平.)，与对照组(转染pTag2b质粒的细胞样本)相比转染了pTag2b-WDR70质粒的细胞样本中WDR70蛋白表达量显著升高，说明重组载体质粒pTag2B-WDR70在A549细胞中能有效表达WDR70蛋白，该重组质粒构建成功.

3结论与讨论

WD重复蛋白家族成员在信号转导、mRNA前体加工、细胞骨架组装及细胞周期调控等诸多生理过程中发挥功能[10-12].WD结构域的共同功能是作为一个稳定的螺旋桨状的平台，介导两种或多种蛋白质相互作用，使得WD重复蛋白形成的β-螺旋桨结构能够识别磷酸化肽[13].WDR70作为WD重复蛋白家族中的重要一员，在介导蛋白质与蛋白质相互作用扮演了重要的角色.关于人类癌症等疾病的长期研究发现WD重复结构域的突变和缺失将导致相关疾病的发生.WDR70基因克隆体系的成功建立，将会对该基因的深入研究打下坚实的基础.

参考文献：

[1]Smith TF, Gaitatzes C, Saxena K, et al. The WD repeat: a common architecture for diverse functions[J].Trends Biochem Sci, 1999,24(5):181-185.

[2]Li D, Roberts R. WD-repeat proteins: structure characteristics, biological function, and their involvement in human diseases[J].Cell Mol Life Sci, 2001,58(14):2085-2097.

[3]Smith TF. Diversity of WD-repeat proteins[J].Subcell Biochem, 2008,48:20-30.

[4]Volk A, Crispino JD. The role of the chromatin assembly complex (CAF-1) and its p60 subunit (CHAF1b) in homeostasis and disease[J].Biochim Biophys Acta, 2015,1849(8):979-986.

[5]Grimmel M, Backhaus C, Proikas-Cezanne T. WIPI-Mediated Autophagy and Longevity[J].Cells, 2015,4(2):202-217.

[6]Mahmoudi S, Henriksson S, Farnebo L, et al. WRAP53 promotes cancer cell survival and is a potential target for cancer therapy[J].Cell Death Dis, 2011,2:e114.

[7]Sato N, Koinuma J, Fujita M, Hosokawa M, et al. Activation of WD repeat and high-mobility group box DNA binding protein 1 in pulmonary and esophageal carcinogenesis[J].Clin Cancer Res, 2010,16(1):226-239.

[8]Sandrini F, Farmakidis C, Kirschner LS, et al. Spectrum of mutations of the AAAS gene in Allgrove syndrome: lack of mutations in six kindreds with isolated resistance to corticotropin[J].J Clin Endocrinol Metab, 2001,86(11):5433-5437.

[9]单宏爽,郭丽丽,慈宏亮,等.人类新基因WDR70的克隆及初步研究[J].微生物学杂志,2005,(1):11-15.

[10]Wang L, Ye X, Liu Y, et al. Aberrant regulation of FBW7 in cancer[J].Oncotarget, 2014,5(8):2000-2015.

[11]Stopa N, Krebs JE, Shechter D. The PRMT5 arginine methyltransferase: many roles in development, cancer and beyond[J].Cell Mol Life Sci, 2015,72(11):2041-2059.

[12]Hwang J, Pallas DC. STRIPAK complexes: structure, biological function, and involvement in human diseases[J].Int J Biochem Cell Biol, 2014,47:118-148.

[13]Bakula D, Takacs Z, Proikas-Cezanne T. WIPI β-propellers in autophagy-related diseases and longevity[J].Biochem Soc Trans, 2013,41(4):962-967.

* 收稿日期：2016-03-26

DOI：10.13698/j.cnki.cn36-1037/c.2016.03.015

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(81402304)；赣南师范学院招标课题(15zb08)

作者简介：杨潮(1984-)，安徽巢湖人，赣南师范学院生命与环境科学学院讲师、博士，研究方向：肿瘤病因学.

中图分类号：R737.33

文献标志码：A

文章编号：1004-8332(2016)03-0058-03

Construction and Identification of Hunman WDR70-expressing Plasmid

YANG Chao1a,1b, YE Mao2, CHEN Hui1a,1b

(1a.SchoolofLifeandEnvironmentScience; 1b.NationalNoval-orangeEngineeringCenter,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China; 2.SchoolofBiology,HunanUniversity,Changsha410082,China)

Abstract:WD repeat protein is a class of proteins containing several conservative WD motif. The family of WD protein extensively exists in eukaryocytes and involved in a variety of biological process, such as cell development, proliferation and apoptosis. WDR70 belongs to WD repeat protein family. At present, the function of WDR70 is not clear. In this experiment, PCR was performed on amplification of WDR70 gene. Then we constructed pCMV-Tag2B-WDR70 recombinant plasmid by homologous recombination. The recombinant plasmid was sequenced and transfected into A549 human lung cancer cells. Finally Western blot was performed to analysis the expression of WDR70 protein. The experimental results showed that WDR70 gene was successfully cloned, and pCMV-Tag2B-WDR70 recombinant plasmid was expressed efficiently in A549 cells. The construction of pCMV-Tag2B-WDR70 recombinant plasmid provides experiment materials for further reserch on WDR70-related biological functions.

Key words:WDR70; WD repeat protein; cDNA cloning

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网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20160510.1226.044.html