具有快速凝乳性能的水牛奶奶酪菌种筛选*

甘敏鑫，吴健程，刘兴胥，吕　军,2**

(1.南宁市新科健生物技术有限责任公司，广西南宁　530003;2.广西科学院生物研究所，广西南宁　530007)

具有快速凝乳性能的水牛奶奶酪菌种筛选*

甘敏鑫1，吴健程1，刘兴胥1，吕军1,2**

(1.南宁市新科健生物技术有限责任公司，广西南宁530003;2.广西科学院生物研究所，广西南宁530007)

摘要：【目的】提高水牛奶产业的经济效益，为广西水牛奶奶酪工业化生产提供参考。【方法】采用平板筛选法从鲜水牛奶和黄牛奶中分离出能够生产水牛奶奶酪的菌种，对筛选到的菌株进行初步的发酵性能试验，并测定其传代稳定性、乳酸和双乙酰含量。【结果】筛选到1株能在4.5 h内使水牛奶凝固的菌株；该菌株在最佳发酵温度37℃下，经过厌氧发酵4.5 h即可使水牛奶完全凝固，所获得凝乳的黏度为109.2 Pa·S，酸度为47.3°T，双乙酰含量为2.826×10-3g/L，乳酸含量为11.59%。【结论】该菌株产酸能力强、产香性能高、黏度和酸度大、有合适的蛋白质水解特性。

关键词：水牛奶凝乳双乙酰奶酪

0引言

【研究意义】水牛奶占全球牛奶总产量的12%，其营养价值高，能提供比普通牛奶更多的单位体积能量，且组分中含有大量的维生素A和D，如应用于日常饮食中，将是解决微量元素及优质动物性蛋白质摄入量的一条良好途径。由于具有极高的总固体含量、脂肪、蛋白质、钙胶体及较大尺寸的酪蛋白胶束和脂肪等特点[1-2]，水牛奶是最适合用于发酵乳制品的牛奶。此外，水牛奶不需要浓缩或者制成奶粉便可做为优质的乳制品。水牛奶所具有的优良理化特点和高营养价值使得水牛奶乳制品具有广阔的开发前景。【前人研究进展】乳制品在发酵过程中，由于各种微生物共存，导致产品容易变质，而乳酸菌产生的乳酸则具有良好的抗微生物作用[3]。在乳制品中，双乙酰对于发酵乳制品的风味与香味尤为重要[4-5]，它已被美国食品药品管理局批准为一种调味品，并用于生产各种口味的食品[6]。刘文俊[7]测定单菌酸奶发酵期间的发酵时间、滴定酸度、pH值、乳酸含量、双乙酰含量等指标，研究菌种发酵、产酸特性和风味物质产量形成的菌株特异性，同时进行产酸、风味物质产量特性的变化规律和相关性分析,并提出乳酸菌发酵过程是个动态的完整过程。因此平均产酸速率是衡量菌株发酵、产酸特性的重要指标。【本研究切入点】广西水牛奶资源丰富，但产品的品种单一，目前只有鲜牛奶和酸奶上市，市面上尚无水牛奶奶酪产品。【拟解决的关键问题】从鲜水牛奶和黄牛奶中筛选能够在短时间内促进水牛奶奶酪凝结的菌株，对筛选到的菌株进行初步的发酵性能试验，并测定其传代稳定性、乳酸和双乙酰含量。

1材料与方法

1.1材料

样品：市面售买的水牛奶和黄牛奶。

斜面培养基为MRS培养基、M17培养基、E培养基和SL培养基，配方参照文献[8-10]，平板培养基在斜面培养基中分别加入0.2%(W/V)碳酸钙。

1.2方法

1.2.1菌种的分离与纯化

将水牛奶和黄牛奶稀释一定倍数后，吸取0.1 mL分别涂布于MRS，M17，E，SL平板培养基上，静置于37℃培养箱中培养48 h，挑选各平板上产酸透明圈明显的菌落划线接入新的平板中进行纯化，对筛选到的菌株进行革兰氏染色后在显微镜下观察其形态，并分别接入对应的MRS，M17，E，SL斜面培养基中，37℃静置培养24 h，保存备用。

1.2.2种子液的制备及菌种凝乳性能初测

纯菌种分别经对应的MRS，M17，E，SL斜面培养24 h后，挑取一环菌体加入装有5 mL水牛奶的试管中，37℃过夜静置培养活化，再以3%(V/V)的接种量将试管中已经凝固的水牛奶转接入5 mL的新鲜水牛奶试管中，37℃静置培养，每小时观察一次水牛奶的凝乳效果，并记录凝固时间，凝固后对其进行感官评定。

1.2.3温度对凝乳的影响

参照1.2.2节制备发酵种子液，分别在31℃、34℃、37℃、40℃、43℃下进行静置发酵6 h后测定凝乳黏度和酸度。其中，黏度采用NDJ-8S数显粘度计测定；酸度测定：准确吸取10 mL凝乳，用25 mL蒸馏水稀释，加入0.5 mL 5 g/L的酚酞指示剂，混匀后用0.1 mol/L的NaOH标准溶液滴定，直至微红色在1 min之内不消失为止。把滴定时消耗的NaOH体积(mL)乘以10，即得凝乳酸度。

1.2.4菌种的稳定性

参照1.2.2节制备发酵种子液，在37℃下发酵4.5 h，观察凝乳状态并测定其黏度和酸度，进行5次传代。

1.2.5双乙酰含量的测定[11]

邻苯二胺和双乙酰反应生成2，3-二甲基喹喔啉，利用反应生成物的盐酸盐在紫外分光光度计335 nm波长下有最大吸收值，可对双乙酰进行定量测定。

取纯化后的菌种经斜面培养24 h后，挑取一环菌体加入装有5 mL水牛奶的试管中，于37℃静置培养18 h进行活化。再以2%(V/V)的接种量接于100 mL水牛奶中，于37℃静置发酵4.5 h后，将凝乳置于蒸馏瓶中，加入50 mL蒸馏水蒸馏。当蒸馏液为50 mL时，停止蒸馏，在蒸馏液中加入50 mL蒸馏水。吸取10 mL于具塞比色管中，向管内加入0.5 mL 1%(V/V)邻苯二胺溶液，摇匀后于暗处放置20 min,然后加入2 mL 4 mol/L盐酸溶液，摇匀，在335 nm下以蒸馏水为空白对照，用紫外分光光度计测定其吸光值。

1.2.6乳酸的测定

取凝乳1 g(精密称定)，加入50 mL蒸馏水和25 mL 1 mol/L的NaOH溶液，煮沸5 min，加入酚酞指示剂2滴，趁热用0.5 mol/L硫酸标准溶液滴定，以蒸馏水为空白对照。乳酸的实际含量W(mg)计算公式如下：

W=90.08×(V0-V)×C×2，

式中，V表示滴定样品所消耗的硫酸体积(mL)，V0为空白试样滴定所消耗的硫酸体积(mL)，C为硫酸浓度(mol/L)。

乳酸溶液的重量百分浓度为

乳酸(%)=(W/W1)×100%，

式中，W为乳酸的实际含量(mg)，W1为称取样品的重量。

2结果与分析

2.1菌落形态

从水牛奶和黄牛奶中分离得到27株菌株，这些菌落在4种培养基上生长的形态主要有圆形白色表面光滑、蘑菇状白色表面光滑、圆形透明表面光滑和片状淡黄表面褶皱等。前3种有产酸与不产酸两种，后者不产酸。其中SL、MRS培养基上的菌落产酸透明圈较大(图1)，M17培养基上的产酸菌落极少，E培养基上的产酸菌落虽较多，但经过发酵培养6 h后，可以使牛奶凝结的却极少。

图1产透明圈的菌落(MRS培养基)

Fig.1Colony which produced transparent circle(MRS culture medium)

在显微镜下观察分离得到的27株菌株的形态，结果如图2所示，有8株(分别为12～15号、17～19号和22号)呈链球状排列，为革兰氏阳性；有12株(分别为1～2号、4～8号、10～11号、16号、20～21号)呈球形或近似球形，为革兰氏阳性；有7株(分别为3号、9号、23～27号)一般呈杆状，也有近卵圆形的，菌体大多平直，亦有稍弯曲的，菌体两端多钝圆，少数是平截状或尖突状，为革兰氏阳性。

2.2凝乳性能

如表1所示，经初步筛选得到的27株菌株，其促使牛奶凝固的时间为4～6 h，凝固后的pH值为3.8～5.5。经过3次传代发酵培养，发现22号菌株的产酸能力强、产香性能高、黏度和酸度大、有适当的蛋白质水解性能，因此，选取22号菌株进行初步的发酵性能研究。

图2显微镜镜检结果

Fig.2Result of microscopic examination

2.3温度对凝乳的影响

如图3所示，22号菌株对发酵温度的变化敏感，发酵温度过高或者过低时其凝乳黏度和酸度均有所下降，当发酵温度为37℃时，其发酵产物的黏度和酸度均最高，其中黏度值为109.2 Pa·S，酸度值为47.3°T。

2.4菌种的稳定性及凝乳中双乙酰和乳酸含量

如表2所示，22号株菌经过5次传代后，其理化性质与第一代相近，表明该菌株传代的稳定性能好。采用22号株菌进行发酵，获得的凝乳中双乙酰的含量为2.827×10-3g/L，乳酸的含量为11.59%。

表1菌株凝乳性能

Table 1Milk clotting properties of bacterial strains

序号No.培养基Culturemedium凝固时间Coagulationtime(h)凝固后pH值pHvalueaftercoagulation凝乳气味Smellofcoagulation凝乳状态*Coagulationstate1SL6.03.8酸,馊Sour,spoiled组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid2SL6.05.1奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,无清液Organizationfine,smooth,noliquid3SL4.04.2奶酸Sourmilk组织粗糙,少许清液Tissueroughness,alittleliquid4SL5.05.1奶酸Sourmilk组织粗糙,少许清液Tissueroughness,alittleliquid5SL6.04.2奶酸Sourmilk组织粗糙,少许清液Tissueroughness,alittleliquid6SL4.54.2奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,较多清液Organizationfine,smooth,alotofliquid7SL6.04.3奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid8SL4.05.5奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid9SL5.04.2奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,无清液Organizationfine,smooth,noliquid10SL4.54.2较酸Sour组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid11SL5.04.3奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid12MRS6.03.8奶酸,稍甜Sourmilk,sweet组织细腻,光滑,无清液Organizationfine,smooth,alittleliquid13MRS4.04.2奶酸Sourmilk组织粗糙,少许清液Tissueroughness,alittleliquid14MRS5.04.2酸,馊Sour,sour组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid15MRS6.04.1奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid16MRS4.03.9奶酸,稍甜Sourmilk,sweet组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid17MRS4.04.0奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,无清液Organizationfine,smooth,noliquid18MRS6.04.7奶酸Sourmilk组织粗糙,少许清液Tissueroughness,alittleliquid19MRS4.53.9奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid20MRS5.04.2奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid21MRS6.04.0奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid22MRS4.54.1奶酸,香甜Sourmilk,sweet组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid23M175.54.2酸,馊Sour,sour组织粗糙,大量清液Tissueroughness,alotofliquid24M175.04.6奶酸Sourmilk组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid25M176.05.1酸,馊Sour,sour组织粗糙,大量清液Tissueroughness,alotofliquid26M175.04.3酸,馊Sour,sour组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid27E6.04.9奶酸,稍甜Sourmilk,sweet组织细腻,光滑,少许清液Organizationfine,smooth,alittleliquid

注：*为发酵6 h后观察结果

Note：*indicates the result of 6 h fermentation

图3温度对凝乳黏度和酸度的影响

Fig.3Effect of temperature on the viscosity and acidity of milk clotting

表2第22株菌的凝乳理化性质

Table 2The physicochemical properties of 22th strains of bacteria

传代数GenerationNo.凝乳状态Coagulationstate黏度Viscosity(Pa·S)酸度Acidity(°T)1+++109.247.32+++108.645.53+++110.346.24+++105.445.85+++108.646.4

注：+表示凝乳效果

Note：+indicates the effect of condensed

3结论

本实验从鲜水牛奶和黄牛奶中成功分离出27株菌株，其形态包括链球状、杆状和球状。其中，以22号菌株的传代稳定性最好，初步的发酵性能结果表明，在37℃下进行发酵，其发酵产物的黏度和酸度均为最佳，分别为109.2 Pa·S和47.3°T，双乙酰含量为2.826×10-3g/L，乳酸含量为11.59%。

参考文献：

[1]SINDHU J S,ARORA S.Milk|buffalo milk[J].Encyclopedia of Dairy Sciences,2011:503-511.DOI:10.1016/b978-0-12-374407-4.00316-2.

[2]HUSSAIN I,YAN J,GRANDISON A S,et al.Effects of gelation temperature on Mozzarella-type curd made from buffalo and cows’ milk:2.Curd yield,overall quality and casein fractions[J].Food Chem,2012,135(3)：1404-1410.DOI:10.1016/j.foodchem.2012.05.110.

[3]BIANCHINI A.Lactic acid bacteria as antifungal agents[M]//HOLZAPFEL W.Advances in Fermented Foods and Beverages.[S.l:s.n],2015:333-353.

[4]吕嘉枥，韩迪，李成涛.乳品中双乙酰检测方法研究[J].食品科学,2007,28(1):275-277.

LV J L，HAN D，LI C T.Study on determination of diacetyl in dairy[J].Food Science,2007,28(1):275-277.

[5]田玉娟，周康，韩新锋，等.乳制品中高产双乙酰乳酸菌的筛选及鉴定[J].食品科学,2015,36(3):162-165.

TIAN Y J，ZHOU K，HAN X F，et al.Isolation and identification of high-level diacetyl-producing lactic acid bacteria from milk products[J].Food Science,2015,36(3):162-165.

[6]SCHAEFFER V,IANNUCCI A.Diacetyl[M]//Reference Module in Biomedical Sciences Encyclopedia of Toxicology (Third Edition).[S.l:s.n],2014:47-50.

[7]刘文俊.嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌产酸、风味特性及其功能基因分型和表达研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2014.

LIU W J.Characteristics of Acid and Flavor-Producing Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus，as Well as Their Functional Gene Typing and Expression[D].Hohhot Municipality:Inner Mongolia Agricultural University,2014.

[8]黄良昌，吕晓玲，姚秀玲，等.保加利亚乳杆菌浓缩培养的研究[J].中国乳品工业,2002,30(1):12-15.

HUANG L C，LV X L，YAO X L，et al.The study on the culture condition of Lactobacillus bulgaricus[J].China Dairy Industry,2002,30(1):12-15.

[9]曹文海，任国谱.嗜热链球菌的检验培养基(M17)的改良[J].中国乳业,2006(1):46-48.

CAO W H，REN G P.Test medium (M17) of Streptococcus pneumoniae[J].China Dairy,2006(1):46-48.

[10]凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社，1999.

LING D W.Classification and Identification of Lactic Acid Bacteria and Experimental Method[M].Beijing:China Light Industry Press，1999.

[11]吕嘉枥，李成涛.酸奶中双乙酰含量的测定方法初探[J].中国乳品工业,2006,34(1):21-31.

LV J L，LI C T.Discussion on the determination of diacetyl in yogurt[J].China Dairy Industry,2006,34(1):21-31.

(责任编辑：陆雁)

收稿日期：2015-11-02

作者简介：甘敏鑫(1985-)，女，工程师，主要从事生物技术研究。 **通讯作者：吕军(1981-)，男，助理工程师，主要从事发酵工程研究,E-mail：304943290@qq.com。

中图分类号：S879.1

文献标识码：A

文章编号：1002-7378(2016)02-0146-05

Strains Screening for Rapid Milk Clotting of Buffalo Milk into Cheese

GAN Minxin1，WU Jiancheng1，LIU Xingxu1，LV Jun1,2

(1.Nanning Newkergen Biotechnology Sciences Co.Ltd.，Nanning，Guangxi，530003，China;2.Biology Institute，Guangxi Academy of Sciences，Nanning，Guangxi，530007，China)

Abstract：【Objective】The objective of this study is to screen strains that can produce cheese from buffalo milk and scalper milk.【Methods】Pure microbial species were isolated from the fresh buffalo milk and cattle milk,which could made buffalo milk coagulate from 4 to 6 h.Then their genetics stability,lactic acid content and diacetyl content were tested.【Results】With preliminary fermentation experiments,the strain 22 was chosen for further experiments,which showed strong acid-producing,high fragrance production,high viscosity and appropriate protein hydrolysate properties.【Conclusion】The results showed that the optimal fermentation condition is at 37℃,for 4.5 h.The resulting cheese has viscosity 109.2 Pa·S,acidity 47.3°T,diacetyl content 2.826×10-3g/L and lactic acid 11.59%.

Key words：buffalo milk，curd，diacetyl，cheese

网络优先数字出版时间:2016-05-12

网络优先数字出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20160512.1516.008.html

修回日期：2015-11-10

*广西自然科学基金青年科学基金项目(2013GXNSFBA019113)资助。