乙型肝炎病毒PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA联合监测相关性分析

2016-07-18 03:15:53刘勇波陈燕如
国际检验医学杂志 2016年12期
关键词:乙型肝炎抗原阳性率

刘勇波,陈燕如

(广东省佛山市南海经济开发区人民医院:1.检验科;2.内科 528237)

·临床研究·

乙型肝炎病毒PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA联合监测相关性分析

刘勇波1,陈燕如2

(广东省佛山市南海经济开发区人民医院:1.检验科;2.内科528237)

目的通过联合检测健康体检者和乙型肝炎患者的乙型肝炎两对半、HBV前S1抗原(PreS1Ag)、抗HBV核心抗体IgM(HBc-IgM)、HBV核酸定量(HBV-DNA)等各项指标,探讨它们之间的相关性及临床意义。方法采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)定量检测“乙型肝炎两对半”,PreS1Ag与抗HBc-IgM检测均采用ELISA检测,HBV-DNA采用实时荧光定量PCR方法检测。结果乙型肝炎组中PreS1Ag、抗HBc-IgM、HBV-DNA的阳性率都明显高于对照组的阳性率,差异有统计学意义(P<0.05)。在4种不同HBV感染模式组别中,抗PreS1Ag和HBc-IgM的阳性率差异均有统计学意义(χ2=9.469,P<0.05;χ2=9.922,P<0.05),HBV-DNA的阳性率差异无统计学意义(χ2=5.848,P>0.05)。114例乙型肝炎患者中,PreS1Ag阳性90例,阳性率为78.9%,HBV-DNA阳性101例,阳性率为88.6%,符合率为89.1%(90/101),两者差异无统计学意义(χ2=0.451,P>0.05),结果呈正相关(r=0.863)。结论PreS1Ag不仅与HBV-DNA检出率高度符合,且是比HBeAg更敏感的判断HBV感染和复制的重要指标,同时抗HBc-IgM与HBV的活动性复制呈正相关,抗HBc-IgM也是HBV在体内复制的重要指标,因此PreS1Ag、抗HBc-IgM以及HBV-DNA 联合乙型肝炎“两对半”对诊断乙型肝炎具有更好的临床意义。

乙型肝炎;乙型肝炎病毒前S1抗原;乙型肝炎病毒核酸定量;抗乙型肝炎病毒核心抗体IgM

目前诊断乙型肝炎最常用的指标是HBV血清学标志物,即乙型肝炎两对半检测[1],而乙型肝炎两对半只能反映人体对HBV的免疫反应状态,不能直接反映HBV在患者体内的复制情况[2]。HBV前S1蛋白是HBV表面蛋白成分中与乙型肝炎表面抗原(HBsAg)氨基末端相连接的多肽,是HBV入侵肝细胞的主要结构成分,在病毒入侵肝细胞过程中起主要作用[3]。国外研究表明,HBV前S1抗原(PreS1Ag)与病毒复制关系密切[4]。因此,PreS1Ag作为HBV感染的标志物越来越被临床重视。抗HBV核心抗体IgM(HBc-IgM)出现于HBV感染早期,也是慢性肝炎复发之前,故HBc-IgM阳性是HBV急性感染和复制活跃的指征[5]。因此,抗HBc-IgM的检测在急性乙型肝炎发病机制中起着重要的作用,并可为这些肝病的临床治疗研究提供新的参考数据。HBV核酸定量(HBV-DNA)是直接反映HBV复制状态及传染性的最佳指标,同时也可用于判断乙型肝炎感染的严重程度和传染性,长期以来有不少专家学者认为HBV-DNA是诊断乙型肝炎,提示病毒复制的“金标准”[6-8]。本研究中收集114例乙型肝炎患者与51例健康患者血清,同时进行PreS1Ag、抗HBc-IgM和HBV-DNA的联合检测,探讨乙型肝炎患者各项指标的相关性及临床意义,为临床诊治乙型肝炎患者提供重要实验室依据。

1资料与方法

1.1一般资料2014年4月至2015年6月在南海经济开发区医院内科住院及门诊确诊为乙型肝炎患者的114例纳入乙型肝炎组,其中男56例,女58例,年龄23~79岁,平均(43.7±6.1)岁;乙型肝炎患者病例的诊断均符合2000年中华医学会西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准。另选择该院预防保健科健康体检者51例纳入对照组,其中男26例,女25例,年龄23~67岁,平均(39.8±8.2)岁。

1.2仪器与试剂乙型肝炎两对半诊断试剂盒购于苏州新波生物技术有限公司,HBc-IgM检测试剂盒和PreS1Ag检测试剂盒购于上海科华生物工程有限公司,HBV-DNA检测试剂盒购于中山大学达安基因股份有限公司。检测仪器包括时间分辨荧光免疫分析仪(ANYTEST-2000,上海新波生物技术有限公司)、全自动酶标洗板机(Egate-2310,上海新波生物技术有限公司)、酶标变频振荡器(新波2510,上海新波生物技术有限公司)。

1.3检测方法

1.3.1“乙型肝炎两对半”定量检测分别加入100 μL阴性、阳性对照和待检血清到反应孔,加完后用封口膜封板。在振荡仪慢速振荡孵育40 min(室温20~25 ℃)。揭下封口膜并弃掉,用洗板机洗涤4次,最后扣干。每孔加入已稀释的铕标记物100 μL,用封口膜封板。然后置于振荡仪慢速振荡孵育40 min(室温20~25 ℃)。揭下封口膜并弃掉,用洗板机洗涤6次。每孔加入增强液100 μL,慢速振荡孵育5 min。用时间分辨荧光测定仪测定各孔的荧光读数。

1.3.2HBV-DNA定量检测用无菌的干燥玻璃管采静脉血2 mL,1 500 r/min离心5 min,吸取上层血清,转移至1.5 mL灭菌离心管。取100 μL血清加入等量DNA浓缩液,振荡混匀5 s;12 000 r/min离心10 min;去上清,沉淀中加入20 μL DNA提取液,振荡混匀5~10 s,瞬时离心数秒,100 ℃恒温处理(10±1)min;12 000 r/min离心5 min。取PCR反应管若干,分别加入处理后的样品上清液2 μL,8 000 r/min离心数秒,放入PCR扩增仪样品槽。将各反应管放入ABI Prism 7300 PCR仪器的微孔反映槽内,在电脑上按对应顺序设置阴性、阳性质控品以及未知标本,并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件,2 h扩增结束后,在电脑的分析菜单下选择自动分析。

1.3.3PreS1Ag和抗HBc-IgM定性检测待测孔加入标本、阴阳性对照各50 μL,封板,置于37 ℃孵育30 min。使用洗板机洗涤5次后拍干。接着每孔加酶结合物50 μL(空白对照孔不加),充分混匀,再次封板,37 ℃孵育30 min。再用洗板机洗涤5次后拍干。每孔加显色剂A、B各50 μL,充分混匀后封板,37 ℃孵育15 min。每孔加终止液50 μL,混匀。立即用酶标仪读数(波长450 nm),读取各孔吸光度(OD)值。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行数据处理及统计学分析,计数资料以例数或百分率表示,组间比较采用χ2检验。所有统计检验均为双侧检验,以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2结果

2.12组3项指标阳性率比较与对照组比较,乙型肝炎组中抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA的阳性率均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 2组3项指标阳性率比较[n(%)]

注:与对照组比较,*P<0.05。

2.2乙型肝炎患者不同HBV感染模式与3项指标的相关性在114例乙型肝炎患者中“大三阳”,“小三阳”,HBsAg与 HBeAg阳性、HBsAg与HBeAb阳性4种不同的感染模式组中,PreS1Ag和HBV-DNA的阳性率呈正相关。在4种不同HBV感染模式组别中,通过χ2检验,抗HBc-IgM和PreS1Ag的阳性率差异都具有统计学意义(χ2=9.922,P<0.05;χ2=9.469,P<0.05),表明抗HBc-IgM和PreS1Ag在4种不同HBV感染模式组别中阳性检出率差异明显。4种不同HBV感染模式组别中,HBV-DNA的阳性率比较,差异无统计学意义(χ2=5.848,P>0.05),说明HBV-DNA的阳性检出率没有明显差异。

表2 乙型肝炎患者不同HBV感染模式与3

2.3乙型肝炎患者PreS1Ag与HBV-DNA相关分析PreS1Ag与HBV-DNA结果比较,差异无统计学意义(χ2=0.451,P>0.05),两者呈显著正相关(r=0.863,P<0.05)。表明在114例乙型肝炎患者中PreS1Ag及HBV-DNA检测结果有较高的符合率,PreS1Ag与HBV-DNA高度相关。

表3 乙型肝炎患者PreS1Ag与HBV-DNA

3讨论

HBV是一种嗜肝细胞病毒,完整的HBV颗粒呈球形,直径为42 nm,具有双层衣壳蛋白,由外壳蛋白和核心成分组成。外壳蛋白即囊膜由脂质双层与蛋白质构成,由S、前S1和前S2组成,包膜内部包裹的是二十面立体对称的内核,内核表面含有乙肝病毒核心抗原(HBcAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg),内核核心成分包括双股DNA和DNA多聚酶[9]。相关研究表明,PreS1Ag已成为感染、复制和乙型肝炎患者诊断、治疗和预后的一项重要指标[10-12]。

本文通过对114例乙型肝炎患者血清检测结果分析发现,PreS1Ag在乙型肝炎组血清中阳性率为78.9%,提示PreS1Ag在一定程度上可作为HBV感染的又一血清标志物。本研究结果显示,乙型肝炎组中抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA的阳性率都明显高于对照组的阳性率。检测中出现少数HBsAg阴性而PreS1Ag阳性的情况,经过分析主要原因可能是HBsAg浓度过高引起的钩状效应、HBV处于潜伏期或者HBsAg分泌量不足,同时也可因为编码HBsAg的HBV中S区发生基因变异。本研究中还出现HBsAg阳性而PreS1Ag阴性的现象,因为PreS1Ag是HBsAg的组成成分之一,可作为HBV感染的标志,但HBsAg不仅存在于完整的病毒颗粒表面,还存在于小球颗粒及管型颗粒,而PreS1Ag只能在完整病毒颗粒表面有效表达,因此可出现HBsAg阳性而PreS1Ag阴性的现象[13]。PreS1Ag阳性率为78.9%,HBV-DNA阳性率为88.6%,两者符合率为89.1%(90/101),两者差异无统计学意义(χ2=0.451,P>0.05),提示呈正相关(r=0.863),因此PreS1Ag与 HBV-DNA 是检测率高度符合的重要病毒复制指标,与邹伟等[14]的研究结果一致。

在乙型肝炎两对半中,HBeAg是HBV核心内部成分,是HBV处于复制状态的标志,但HBeAg阴性并不意味着HBV复制的完全终止或病毒血症的消失,可能是HBV基因组的前C区发生变异而导致HBeAg表达障碍,这时PreS1Ag检测阳性比HbeAg更能反映HBV复制情况,因此,PreS1Ag作为HBV病毒感染、复制的指标比HbeAg更敏感,有独立检测的价值,对乙型肝炎两对半检测起重要的补充作用。表2显示,HBV-DNA和PreS1Ag在4种不同HBV感染模式组别的阳性率都较高,并且HBV-DNA和PreS1Ag的阳性率在HBeAg阳性组明显高于HBeAg阴性组,提示PreS1Ag、HBV-DNA和 HBeAg三者关系密切,在HBV复制时表达最多,可作为HBV存在及病毒复制和有传染性的指标[15]。

HBV感染机体后,体液免疫反应首先产生以抗HBc-IgM为主的免疫球蛋白,随后IgM抗体滴度下降,而IgG效价迅速上升。因此,抗HBc-IgM可以作为HBV感染早期诊断的指标,以往认为抗HBc-IgM可作为HBV近期感染的血清学标记,但后来发现在慢性乙型肝炎中也有较多阳性者。因此,抗HBc-IgM阳性是HBV在体内复制的重要指标,提示患者近期有HBV感染或慢性乙型肝炎患者的HBV有活动性复制,患者有很强的传染性。本研究结果显示,在4种不同HBV感染模式组别中,抗HBc-IgM的阳性率差异有统计学意义(χ2=9.922,P<0.05),表明抗HBc-IgM在4种不同HBV感染模式组别中阳性检出率具有明显差异。本研究中,抗HBc-IgM在“大三阳”和“小三阳”中的阳性率分别为39.2%和29.2%。表明抗HBc-IgM与HBV的活动性复制呈正相关。

外周血清中HBV-DNA的检测反映完整HBV颗粒的释放,是检测病毒复制最直接可靠的指标。本研究中,HBV-DNA在“大三阳”组的检出率为90.2%,但同时也存在HBV-DNA阴性的患者,其原因可能为药物抑制HBV-DNA复制,但仍存在低水平病毒复制的可能,只是浓度低于检测下限(<500),也可能标本内含有抑制扩增反应的物质,如含有Taq DNA聚合酶抑制物。在4种不同HBV感染模式组别中HBV-DNA的阳性率比较,差异无统计学意义(χ2=5.848,P>0.05),说明HBV-DNA的阳性检出率没有明显差异。荧光定量PCR对实验室要求条件较高,一般基层医疗单位还很难开展。相关研究报道,PreS1Ag与HBV-DNA有较好的一致性,但又存在一定的交叉阳性和交叉阴性[16]。因此,PreS1Ag不能等同或替代HBV-DNA的检测,在临床诊断中应充分依据两种指标的独立性和互补性来诊治患者。

综上所述,PreS1Ag是比HBeAg更敏感的判断HBV感染和复制的重要指标,能够弥补由于HBeAg阴性情况下给临床诊断和治疗带来的“误导”,抗HBc-IgM与HBV的活动性复制呈正相关,可以作为乙型肝炎检查的常规项目,因此抗HBc-IgM、PreS1Ag及HBV-DNA 联合乙型肝炎“两对半”对诊断乙型肝炎具有更好的意义。

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2016-01-28修回日期:2016-03-18)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.055

A

1673-4130(2016)12-1722-03

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