普通荞麦种内丝裂原活化蛋白激酶序列分析

梁成刚， 陈晴晴， 石桃雄， 陈其皎， 孟子烨， 陈庆富

(贵州师范大学 荞麦产业技术研究中心/贵州省荞麦工程技术研究中心，贵州 贵阳 550001)



普通荞麦种内丝裂原活化蛋白激酶序列分析

梁成刚， 陈晴晴， 石桃雄， 陈其皎， 孟子烨， 陈庆富

(贵州师范大学 荞麦产业技术研究中心/贵州省荞麦工程技术研究中心，贵州 贵阳 550001)

摘要：【目的】比较普通荞麦Fagopyrum esculentum种内丝裂原活化蛋白激酶基因(MAPK)序列的差异，研究MAPK基因序列在普通荞麦栽培进化过程中的变化。【方法】以普通荞麦的9个栽培品种和3个落花落果野生种质为材料，PCR特异性扩增获得MAPK基因的保守片段，对基因片段序列进行差异分析和蛋白结构预测。【结果】荞麦MAPK基因cDNA全长为2 835 bp，开放阅读框1 827 bp,编码609个氨基酸，含有TDY的三肽模块，为植物D组MAPK蛋白。PCR扩增获得12个供试材料的MAPK序列，其单型不变位点为723个，多态位点为70个。9个栽培品种间开放阅读框(ORF)区域无序列差异，3个野生种质间ORF区域也无序列差异。栽培品种与野生品种的ORF区域序列含有8个差异位点，编码3个差异氨基酸。其中，ORF区域第13位点组氨酸(H)→酪氨酸(Y)发生置换，导致1个α-螺旋构象发生变化。【结论】普通荞麦MAPK基因序列高度保守，栽培驯化对ORF区域第13位点差异氨基酸的选择具有高度一致性。

关键词：普通荞麦；丝裂原活化蛋白激酶；序列分析；氨基酸位点；蛋白结构

荞麦Fagopyrum起源于中国的西南地区，是我国重要的杂粮作物之一[1]。荞麦具有食药兼用特性，营养价值丰富、药用保健效果较好[2-3]。例如荞麦所富含的黄酮类化合物，尤其是芦丁具有明显的降血糖、降血脂和降血压功效[4]。由于荞麦具有生育期短、耐贫瘠特性，特别适合在高寒地区种植[5]。普通荞麦Fagopyrum esculentum又名甜荞，包含栽培和野生类型。栽培甜荞种植面积较广，在我国南北地区均有栽培。野生甜荞是栽培甜荞的祖先，主要分布于中国西南地区，特别是西藏、云南和四川，其形态与栽培甜荞非常相似，但具有落花、落果习性[1, 6-7]。植物丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)是生物信号传递网络中的重要信号分子[8-10]。MAPK级联途径通过调节植物细胞分裂、分化及凋亡等过程，调控植株生长和发育[9, 11-12]。不仅如此，MAPK信号通路还在植物激素代谢以及逆境胁迫应答调控方面发挥重要作用[11, 13-15]。高华健等[16]研究发现MAPK通过调节H2O2和生长素的平衡可以调控水稻幼苗根系的生长。梁卫红等[17]研究发现逆境胁迫如高盐、低温和脱落酸能使OsMAPK14基因表达上调，进而降低逆境对水稻生长发育的影响。此外，有研究指出MAPK可与IDA(Inflorescence deficient in abscission)、HAE(受体蛋白激酶HAESA)和HSL2(HAESA-like 2)共同作用，调控离层细胞的程序化死亡，进而参与调控植物花器官的脱落过程[18]。目前鲜见有关荞麦MAPK基因的相关报道。本试验根据前期转录组基因测序所得到MAPK的Unigene 序列，设计特异性引物，经PCR扩增测序分析普通荞麦栽培品种与野生种质间此基因片段序列的差异，以期为荞麦MAPK基因功能研究与荞麦的花果器官脱落、起源与进化等相关研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

普通荞麦：9个栽培品种， 3个具有落花、落果习性的野生种质，均由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供(表1)。使用1.25 mL· L-1新洁尔灭溶液对种子消毒后放置于25 ℃光照培养箱，待种子发芽后播种于含腐殖土的花盆。

表1供试的普通荞麦材料

Tab.1The common buckwheat materials used in this study

编号材料花果脱落习性收集地E1榆林甜荞不落陕西E2宁荞1号不落宁夏E3信农1号不落宁夏E4赤甜1号不落内蒙古E5定甜2号不落甘肃E6平荞2号不落甘肃E7威甜1号不落贵州E8自花甜荞不落贵州E9综甜1号不落贵州WE1野生甜荞1易落西藏WE2野生甜荞2易落云南WE3野生甜荞3易落云南

1.2PCR扩增与测序

根据前期转录组基因测序所得到的荞麦Unigene序列，进行基因功能注释和数据库基因序列比对，获得荞麦MAPK序列片段。根据MAPK基因序列片段的保守区域，利用Primer5.0软件设计正向特异性引物5′-GTGTTGCTCACCAGTTGGATT-3′和反向特异性引物5′-GTCAGTGGGGTGACCTATCTT-3′。幼苗期对供试材料植株嫩叶进行取样，使用改良CTAB法提取DNA，PCR扩增参考陈晴晴等[19]的方法。PCR反应体系总体积为60 μL，包含2×Taq PCR MasterMix 30 μL，5 μmol·L-1引物各6 μL，40 ng·μL-1DNA模板和ddH2O 9 μL。扩增反应体系为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性60 s， 退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.3序列分析与进化树的构建

在本地数据库(未发表)对前期转录组测序所获得的荞麦MAPK 基因的Unigene序列进行Nucleotide blast，获得荞麦MAPK基因的cDNA序列；在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上使用Nucleotide blast对测序获得的基因片段序列进行在线比对；使用Protein blast进行氨基酸序列的在线比对。使用ClustalW软件进行多序列比对分析；使用DNAssist2.2和MEGA6软件进行核酸和氨基酸序列差异分析；使用MEGA6软件构建系统进化树。在网页(http://swissmodel.expasy.org/workspace)上使用Swiss-model对MAPK片段进行蛋白质结构在线预测[20-22]。

2结果与分析

2.1荞麦MAPK基因序列

对荞麦转录组基因测序所得到的Unigene进行基因功能注释和数据库基因序列比对，获得MAPK的Unigene序列。在本地基因组数据库中对该Unigene基因序列进行Nucleotide blast分析，获得荞麦MAPK序列。生物信息学分析发现，该基因cDNA序列全长为2 835 bp，碱基组成为A占29.5%、C占20.6%、G占22.1%、T占27.8%。荞麦MAPK基因含有1个1 827 bp的开放阅读框(ORF)，编码609个氨基酸。从图1可知，该ORF区域编码的氨基酸包含TDY的三肽模块，为植物D组MAPK蛋白的典型结构。NCBI数据库在线使用Nucleotide blast对所获得的荞麦MAPK基因序列进行比对。结果发现荞麦MAPK基因序列与陆地棉Gossypiumhirsutum、烟草Nicotianatabacum、可可Theobromacacao等数十个物种上百个已知MAPK家族基因序列的相似性高于70%，属于高度同源。因此，认为该基因为植物MAPK基因D组中的一员。

*标记MAPK典型的TDY结构。

2.2丝裂原活化蛋白激酶的PCR扩增

提取普通荞麦9个栽培品种和3个野生种质植株幼嫩叶片的DNA，利用特征引物扩增MAPK基因序列。琼脂糖凝胶电泳检测发现，12个供试材料中PCR扩增得到的产物在约900 bp处产生特异性条带；测序结果发现，E1中产生的特异条带序列片段为886 bp(图2)。对序列片段进行本地数据库Nucleotide blast比对分析，结果发现该片段部分序列与普通荞麦MAPK基因cDNA片段部分序列相似性达到100%(图3)，说明PCR扩增产物即为普通荞麦MAPK基因片段。

M：Marker条带；P:阳性对照。

图2普通荞麦特异引物PCR扩增结果

Fig.2Amplification products of common buckwheat DNA using specified primers

图3　普通荞麦DNA序列比对结果

2.3丝裂原活化蛋白激酶的进化分析

利用DNAssist软件对E1中目标片段基因序列进行分析，结果发现该片段含有1个序列为300 bp的开放阅读框(ORF)，编码1个MAPK蛋白保守结构域，与烟草、陆地棉、桑树等20余个物种中上百个已知的MAPK家族蛋白序列相似性达78%～88%。通过Protein blast比对得到与普通荞麦MAPK蛋白片段序列相似性较高的烟草(AFP20229.1)、陆地棉(AJA29662.1；AAZ83349.1)、中棉(ACC63895.1)、野芭蕉(ABF69963.1；AIU98489.1)、苜蓿(XP 013445445.1)、杨树(XP 002298926.1)、花生(ABI95363.1)、蓖麻(XP 002528477.1)、桑树(AIE11757.1)MAPK蛋白片段序列。利用MEGA6软件对其进行系统进化分析，从聚类图可知，同一物种或亲缘关系较近物种的MAPK序列差异较小，被聚在一起。由图4可知，普通荞麦栽培品种与野生种质的MAPK蛋白被聚在一起，亲缘关系近。

2.4普通荞麦丝裂原活化蛋白激酶序列差异分析

对12个供试材料扩增得到的目标基因片段序列进行分析，结果发现该片段序列的相对碱基组成频率差别不大，A为28.81%、T(U)为32.73%、C为18.30%，G为20.15%，A+T含量(61.54%)明显高于C+G(38.46%)。使用ClustalW对该片段序列进行多重比较分析，去掉序列两端缺失导致排列不整齐的位点，对其中793个位点进行多态性统计，结果发现在12个供试材料中该基因序列片段的不变位点为723个，多态位点为70个(包含简约信息位点数43个)。其中，在9个栽培品种间多态位点仅为22个(包含简约信息位点数10个)，3个野生材料间多态位点为25个。

使用ClustalW对12个供试材料MAPK基因片段序列进行比较，结果发现普通荞麦9个栽培品种ORF区域序列无位点差异，高度保守；3个野生材料中ORF区域序列也无位点差异，高度保守；但栽培品种与野生材料ORF区域序列含有8个差异位点。对ORF编码的氨基酸序列进行分析发现，普通荞麦栽培品种与野生材料ORF结构域氨基酸序列存在3个变异位点(表2)。

图4　不同植物MARK蛋白序列的聚类分析

Tab.2The differential sites of the nucleotides and amino acids in MARK ORF fragments between cultivars and wild types of common buckwheat

样品编号碱基位点氨基酸位点8376712918920421024931323E1GTAATGGCYHME2GTAATGGCYHME3GTAATGGCYHME4GTAATGGCYHME5GTAATGGCYHME6GTAATGGCYHME7GTAATGGCYHME8GTAATGGCYHME9GTAATGGCYHMWE1ACTGGACTCYLWE2ACTGGACTCYLWE3ACTGGACTCYL

2.5普通荞麦丝裂原活化蛋白激酶结构预测

使用Swiss-model对MAPK的ORF片段进行蛋白质结构在线预测，结果发现普通荞麦栽培品种和野生种质材料间ORF蛋白结构存在明显的构象差异。从图5中可知，与栽培品种相比，3个氨基酸差异位点导致野生种质材料ORF蛋白的1个α-螺旋构象发生改变。进一步对3个氨基酸位点单位点置换后进行蛋白质结构预测，结果发现ORF第13位点组氨酸(H)→酪氨酸(Y)发生转换导致蛋白结构域发生构象变化(图5D)，而其余2个氨基酸位点的转换并不影响蛋白的构象(图5C、5E)。

A：栽培品种； B: 野生种质; C、D、E分别为栽培品种MAPK蛋白第3位点Y→C(C)、第13位点H→Y(D)和第23位点M→L(E)发生转换后的结构域；箭头指向结构发生改变的区域。

图5普通荞麦MARK蛋白结构域分析

Fig.5Domain analysis of MAPK protein of common buckwheat

3讨论与结论

荞麦起源于我国西南地区，种植历史悠久。荞麦生育期短、生长适应性强、抗逆性较强，在历史上一直作为一种重要的救灾粮食作物[5]。植物MAPK基因是MAPK级联信号途径中的关键信号分子，在逆境胁迫应答方面具有重要调控作用[10-11]。生物信息学分析发现荞麦MAPK序列全长为2 835 bp，包含1个1 827 bp的ORF，编码609个氨基酸。植物MAPK具有典型的TEY区或TDY区的模块，其中，TEY类分为A、B、C 3组，TDY类则单独为D组[11]。荞麦MAPK序列中含有2个TDY模块，属于D组MAPK蛋白。

通过PCR扩增和目标片段测序得到的目标基因片段的部分序列与MAPK基因部分序列相似性达到100%，因此认为PCR扩增得到的产物即为普通荞麦MAPK基因片段。特定基因序列间的差异可作为研究物种进化关系的依据[23]。在线Blast比对发现，普通荞麦MAPK片段序列与近缘植物，例如陆地棉的MAPK1基因(KM190106.1)序列相似性高于80%，其ORF区域编码1个MAPK蛋白保守结构域，与陆地棉(AJA29662.1；AAZ83349.1)MAPK蛋白等序列相似性均高于80%，说明植物MAPK基因序列在进化过程中较为保守。李凤梅[25]研究发现植物丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)基因序列高度保守。本研究发现12个供试材料间MAPK基因片段序列793个位点中多态位点为70个，ORF区域序列多态位点仅为8个。尤其是9个栽培甜荞间MAPK基因片段ORF区域序列无差异位点，3个野生甜荞间MAPK基因片段ORF区域序列无位点差异，说明栽培驯化过程中普通荞麦MAPK基因序列高度保守。

Cho等[18]研究发现，MAPK基因参与调控了植物花器官的花梗离层细胞程序化死亡的过程，进而介导花器官的脱落。Meng等[26]研究指出，拟南芥中MAPK级联信号下游ERECTA受体蛋白激酶通过促进细胞增殖进而调控花梗形态建成。野生甜荞是栽培甜荞的祖先，易落花落果[1]。克服落花落果习性一直是普通荞麦栽培驯化的一个主要目标。对普通荞麦MAPK基因片段ORF区域序列分析发现，栽培甜荞与野生甜荞间存在8个碱基差异位点，编码3个差异氨基酸，导致1个α-螺旋构象发生改变。此外，研究还发现9个栽培甜荞间ORF区域序列高度一致，3个野生甜荞间ORF区域序列也保持高度一致。说明人工栽培驯化对这3个差异氨基酸位点的选择具有高度一致性。与9个栽培甜荞相比，供试的3个野生甜荞均具有落花落果习性。对3个差异氨基酸位点进行单位点置换的蛋白结构预测，结果发现α-螺旋构象变化是由ORF区域第13位点组氨酸(H)→酪氨酸(Y)发生置换所导致，暗示其可能与野生甜荞落花进化为不落花型栽培甜荞事件有关。研究结果为进一步研究荞麦MAPK基因功能以及栽培进化提供了理论基础。

致谢：感谢贵州师范大学黎瑞源老师给予的支持和帮助！

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【责任编辑庄延，周志红】

Sequence analysis of mitogen-activated protein kinases of common buckwheat, Fagopyrum esculentum

LIANG Chenggang, CHEN Qingqing, SHI Taoxiong, CHEN Qijiao, MENG Ziye, CHEN Qingfu

(Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University / Buckwheat Engineering Research Center of Guizhou Province, Guiyang 550001, China)

Abstract：【Objective】To identify the difference of mitogen-activated protein kinase gene (MAPK) sequences among intraspecific common buckwheat, Fagopyrum esculentum, and study the sequence change during the chronical domestication process. 【Method】 The common buckwheat varieties, containing nine cultivars and three wild types with shattering habit, were selected for PCR amplification of the conservative fragments of MAPK gene. Sequences were analyzed and protein conformations were predicted. 【Result】 The full length of buckwheat MAPK cDNA was 2 835 bp, the length of the open readling frame (ORF) was 1 827 bp, and 609 amino acids containing the TDY tripeptide module were encoded. The buckwheat MARK belonged to the group D of plant MARK proteins. A total of 723 invariable sites and 70 polymorphic sites in MAPK sequence of common buckwheat were identified in 12 tested materials. We did not find difference among the ORF sequences of nine cultivars, neither among three wild types. There were eight differential nucleotides in the ORF of MAPK gene which encoded three amino acid polymorphisms between the cultivars and wild types. We found a change of α-helix conformation which was induced by transforming histidine (H) to tyrosine (Y) at the 13th site in the ORF of MARK. 【Conclusion】 The MAPK sequence is highly conserved and the 13th amino acid site has been highly consistently selected during the chronical process of domestication.

Key words：Fagopyrum esculentum; MAPK; sequence analysis; amino acid site; protein conformation

收稿日期：2015- 11- 04优先出版时间：2016- 06- 01

作者简介：梁成刚(1985—)，男，助理研究员，博士，E-mail: jesselcg@163.com；通信作者：陈庆富(1966—)，教授，博士，E-mail: cqf1966@163.com

基金项目：国家自然科学基金 (31471562，31171609)；国家燕麦荞麦现代农业产业技术体系专项(CARS- 08-A4)；贵州省高层次创新型人才培养对象十百千计划(2014GZ97588)；贵州省荞麦工程技术研究中心项目(黔科合农G字【2015】4003号)。

中图分类号：S517；S321

文献标志码：A

文章编号：1001- 411X(2016)04- 0090- 07

优先出版网址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20160601.1353.020.html

梁成刚，陈晴晴，石桃雄， 等.普通荞麦种内丝裂原活化蛋白激酶序列片段分析[J].华南农业大学学报，2016,37(4):90- 96.