阿托伐他汀及尼可地尔后处理对兔缺血再灌注损伤心肌的保护作用

李艳芳 费丽萍 刘云江（长治医学院附属和济医院心内科，山西 长治 046000）



阿托伐他汀及尼可地尔后处理对兔缺血再灌注损伤心肌的保护作用

李艳芳 费丽萍 刘云江
（长治医学院附属和济医院心内科，山西 长治 046000）

【摘要】目的 建立缺血再灌注模型，观察阿托伐他汀、尼可地尔后处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并对其作用机制进行研究。方法50只大白兔随机分成5组A～E（空白对照组A组、平行对照组B组、阿托伐他汀组C组、尼可地尔组D组、联合后处理组E组），采用“二线二结法”建立缺血再灌注模型。各组按照实验设计方案给药。试剂盒检测SOD、MDA。电镜检测心肌超微结构的变化。RT-PCR检测HIF-1α。结果 ①与A组相比，B～E组血清MDA含量明显增加(P<0.05)，而SOD明显降低(P<0.01)；与B组比较，C～E组血清MDA含量显著降低(P<0.01)，SOD活性显著提高(P<0.01)；与C、D组比较，E组MDA含量及SOD活性均无显著性差异(P>0.05)。②电镜观察，缺血后处理组心肌细胞的损伤明显减轻。③RT-PCR检测HIF-1α，与A组相比，B～E组HIF-1αmRNA表达增高(P<0.01)，显示缺血再灌注能增强其表达；其中C～E组又较B组增高(P<0.05)，显示缺血后处理更能增强其表达。结论 ①阿托伐他汀、尼可地尔后处理对兔心肌缺血再灌注损伤有保护作用，可以改善再灌注后心肌的组织结构。②阿托伐他汀、尼可地尔后处理可能通过减轻氧化应激、减轻细胞凋亡发挥心肌保护作用。【关键词】阿托伐他汀；尼可地尔；再灌注损伤；药物后处理

急性心肌梗死严重危害人类健康，及时开通罪犯血管是治疗本病的重要方法，但是长时间心肌缺血后的再灌注会引起心肌细胞的缺血再灌注损伤[1]。2005年Staat等[2]率先在临床上证实了缺血后处理的心肌保护作用。药物后处理是指在缺血之后、再灌注之前使用模拟内源性保护机制的药物来产生类似经典后处理的保护作用。寻找对再灌注器官有保护作用的药物可能更适合临床。

本研究通过建立缺血再灌注模型，观察阿托伐他汀、尼可地尔及二者联合用药后处理对大白兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并对其可能的保护机制进行研究，以期为临床心肌缺血再灌注保护的药物选择提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物：健康大白兔50只，雌雄占各半，体质量1.5～2.5 kg，由长治医学院动物部供应。按照“山西省医学类实验动物饲养及管理条例”及“国际实验动物管理条例”进行喂养和处理实验动物。

1.2 试剂：阿托伐他汀辉瑞制药公司；尼可地尔中外制药株式会社；SOD、MDA测试盒南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器：721分光光度仪：上海第三分析仪器厂；H-7500透射电子显微镜：日立。

1.4 方法及实验流程

1.4.1 分组、建模：50只大白兔随机分成5组（空白对照组A组、平行对照组B组、阿托伐他汀组C组、尼可地尔组D组、联合后处理组E组），采用“二线二结法”建立缺血再灌注模型[3]。A组在穿线30 min后灌胃生理盐水5 mL，B～E组分别在缺血30 min后灌胃生理盐水5 mL、阿托伐他汀30 mg/kg+生理盐水5 mL、尼可地尔4 mg/kg+生理盐水5 mL、阿托伐他汀30 mg/kg+尼可地尔4 mg/kg+生理盐水5 mL。给药20 min后（即缺血50 min）恢复再灌注，再灌注2 h。

1.4.2 血液标本采集及指标检测：各组分别于结扎前、开放2 h经股动脉采血2 mL，4000 rpm离心10 min，-70 ℃保存，试剂盒检测SOD、MDA。

1.4.3 心肌超微结构电镜观察：每组随机选择5只兔子进行心肌超微结构观察。再灌注结束后，结扎线以下2 mm处取标本并修剪为1 mm3大小，行前固定后置于缓冲液中冰箱4 ℃保存备用。

1.4.4 HIF-1α的RT-PCR检测：①总RNA提取。②RT（逆转录）。③real-time PCR（聚合酶链反应）。

反应体系如下：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）10 µL，上游引物（15 µmol/L）0.5 µL，下游引物（15 µmol/L）0.5 µL，cDNA 2 µL，无DNAse和RNAse的水7 µL，共20 µL。

PCR反应条件如下：94 ℃预变性10 min，活化Tag酶；94 ℃15 s，60 ℃60 s，共循环45次。

荧光定量PCR读取CT（cycle threshold）值，利用2-ΔΔCT进行计算[4]，表示实验组测定指标X的表达相对于对照组样本X表达的变化倍数。1.4.5 统计学分析：用SPSS17统计软件包进行统计处理，组间比较及组内比较分别采用one-way ANOVA分析和LSD-t检验，P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 再灌注2 h血清MDA、SOD指标检测结果比较见表1。

表1 再灌注2 h血清MDA、SOD指标检测结果比较(±s)

表1 再灌注2 h血清MDA、SOD指标检测结果比较(±s)

注：与B组比较▲P＜0.01

分组　MDA(nmol/mL)　SOD(U/mL) A 5.58±0.82　134.23±6.08 B 8.26±0.90　90.96±3.84 C 6.32±0.39▲　122.98±3.39▲D 6.52±0.63▲　118.88±8.66▲6.54±1.01▲　117.66±7.61▲E

2.2 心肌超微结构变化：A组心肌细胞排列整齐，结构完整，Z线清楚，线粒体结构完整；B组心肌排列模糊，不整齐，细胞水肿，Z线不清，线粒体严重肿胀，并空泡化；C～E组心肌纤维排列轻度模糊，细胞轻度水肿，线粒体轻度肿胀，脊模糊。心肌组织的电镜观察结果见图1。

图1 心肌组织的电镜观察结果（×20000倍）

2.3 HIF-1α的检测：与A组相比，B-E组HIF-1αmRNA表达增强（P<0.01），显示缺血再灌注能增强其表达；其中C-E组又较B组增高（P<0.05），说明缺血后处理更能增强其表达。

3 讨 论

药物后处理对缺血再灌注损伤心肌的保护作用是目前心肌保护领域的研究热点。他汀类药物的多效性近年来被给予较多关注，调脂之外还有改善内皮细胞、抗炎、稳定斑块、抗细胞凋亡等多效性[5]。尼可地尔对体外培养的心肌细胞有抗凋亡作用[6]。目前研究认为抑制氧自由基的堆积、减轻氧化应激是缺血再灌注保护作用机制之一[7]。本研究显示，经后处理组织超氧化物歧化酶（SOD）升高，脂质过氧化物产物丙二醛（MDA）显著降低，进一步证明后处理通过减少再灌注初期的氧自由基的生成，抑制细胞膜的脂质过氧化反应，减轻氧化应激，保护再灌注器官。Piot等[8]证实了细胞凋亡及坏死均存在于缺血再灌注损伤心肌中，并且其心肌梗死面积的大小与缺血再灌注损伤后的细胞凋亡的严重程度相关。研究发现[9]，缺血预处理与后处理的心肌保护作用可能与促进激活低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的高表达有关。组织缺血缺氧时可启动一系列应答反应，其中HIF-1是一种关键性的转录因子，可调控近200个下游基因的转录激活来介导组织细胞对缺氧的适应性反应。并且心肌细胞的凋亡数明显减少，提示HIF-1α的心肌保护作用可能与抑制心肌细胞凋亡有关[10]。本研究结果认为阿托伐他汀、尼可地尔对缺血再灌注心肌有保护作用，可能通过改善氧化应激、减轻细胞凋亡发挥作用。

参考文献

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[2] Staat P,Rioufol G.Postconditioning the human heart[J].Circulation, 2005,112(14):2143-2148.

[3] 薛枫,杨向军.兔在体心脏缺血再灌注模型的制作方法的改进[J].中国比较医学杂志,2010,20(2):51-53.

[4] Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucl Acids Res,2001,29(10):2002-2007.

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[6] Nagata K,Obata K,Odashima M,et al.Nicorandil inhibits oxidative stress-induced apoptosis in cardiac myocytes through activation 0f mitochondrial ATP-sensitive potassium channels and nitrate-like effect[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(12):1505-1512.

[7] Tsutsumi YM,Yokoyama T.Reactive oxygen species trigger ischemic and pharmacological postconditioning: in vivo and in vitro characterization[J].Life Sci,2007,81(15):1223-1227.

[8] Piot CA,Padmanaban D,Ur sell PC,et al.Ischemic preconditioning decreases apoptosis in rat hearts in vivo [J].Circ,1997,96(5):1598-1604.

[9] 宋建瑞,卫立辛.低氧诱导因子-1与细胞凋亡关系的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志,2009,16(8):636-639.

[10] 郝潇,李树仁.低氧诱导因子1对心脏保护作用的研究进展[J].基础医学与临床,2015,35(4):554-556.

中图分类号：R54

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）11-0005-02

基金项目：长治市科技局课题（20123059）

The Research of the Cardio Protective Effect of Ischemic Postcondi tioning against Myocardial Ischemia and Reperfusi on Injury in Rabbit

LI Yan-fang, FEI Li-ping, LIU Yun-jiang
(Department of Cardiology, Heji Hospital Affiliated to Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

[Abstract]Objective To observe the cardio protective effect of myocardial ischemic postconditioning against ischemia and reperfusion induced injury in rabbit heart. Methods 50 rabbits were randomly divided into 5 groups, and the myocardial ischemia-reperfusion were generated by two sutures and two knots, and then administrated in accordance with the experimental design, testing SOD and MDA in serum, observing the changes of myocardial structure, testing HIF-1α by RT-PCR. Results The MDA levels of group C-E were significantly lower than B (P<0.01) but the SOD were higher than B (P<0.01). The injury of group B was worse than C-E of the cellular structure under EM. The HIF-1αmRNA levels of group B-E were higher than that of group A（P<0.01), and C-E higher than B (P<0.05). Conclusion Myocardial isehemic postconditioning of atorvastatin and nicorandil induced cardio protection against ischemia reperfusion injury in rabbits. They can improve structure under microscope, maybe through reducing oxidative stress and reducing cell apoptosis.

[Key words]Atorvastatin; Nicorandil; Pharmacological postconditioning; Ischemia and reperfusion injury