顶孢霉孢子悬浮液对小麦和黄瓜种子萌发及六种作物幼苗生长的影响

郝雨,杨顺义,张新虎,沈慧敏,岳秀利,罗玲艳

(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统省部共建教育部重点实验室,中-美草地畜牧业可持续发展中心,甘肃 兰州　730070)



顶孢霉孢子悬浮液对小麦和黄瓜种子萌发及六种作物幼苗生长的影响

郝雨,杨顺义,张新虎,沈慧敏,岳秀利,罗玲艳

(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统省部共建教育部重点实验室,中-美草地畜牧业可持续发展中心,甘肃 兰州730070)

摘要：【目的】 研究顶孢霉Ahy1对作物的安全性及生理指标的影响.【方法】 采用室内生测和生理生化分析法，测定了顶孢霉(Ahy1)孢子悬浮液对小麦和黄瓜种子萌发、体内酶活性以及对6种作物幼苗生长的影响.【结果】 在25 ℃，相对湿度75%条件下，不同浓度的悬浮液对小麦和黄瓜种子萌发及根长生长表现出高抑和低促作用；对小麦种子中4种酶的活性均有不同程度的促进作用；对黄瓜种子中SOD、POD表现为促进作用，相对抑制率分别为-82.51%和-35.96%，对CAT有明显的抑制作用，对Pro含量影响不明显.对菜豆、小麦、玉米、辣椒、茄子、黄瓜6种供试作物株高平均抑制率分别为-18.62%、-8.12%、-11.11%、-8.56%、-6.61%和-1.71%；对菜豆、小麦幼苗鲜质量的相对抑制率分别为-21.10%、-14.29%，对辣椒、菜豆、茄子和小麦干质量抑制率分别为-16.41%、-15.59%、-15.10%和-9.50%，表现促生作用，但对黄瓜和玉米的干质量表现抑制作用.【结论】 Ahy1菌株不同浓度孢子悬浮液处理供试作物21 d后，均未见任何发病症状，植株生长正常，对供试作物生长没有明显可见影响.

关键词：顶孢霉孢子悬浮液；幼苗株高；鲜质量；干质量；种子萌发率；根长生长；生理指标

随着农业生产中滥施化学农药带来的环境与食品安全问题的日趋势严重，非化学农药防治病虫害的研究开始得到人们的重视.微生物杀虫剂具有易被降解，对人畜和益虫无害，昆虫对其不易产生抗性，且具有高特异性等优点[1]，如虫生真菌制剂，已有试验测试了某些虫生真菌对脊椎动物的影响，只发现了较小的过敏反应[2-3].真菌杀虫剂具有对环境友好、杀虫方式独特、害虫不易产生抗性、使用范围广、容易大量生产等特点，是最安全、效果最佳的生物农药[4-6].研究我国丰富的杀虫真菌微生物资源，开发适宜于甘肃省干旱条件下生产和应用的真菌微生物杀虫剂，对保护生态环境具有十分重要的意义.

顶孢霉(A.hansfordii)是一种虫生真菌[7-8]，甘肃农业大学农药系从蚜虫上分离获得一株顶孢霉菌株Ahy1，并对获得的Ahy1菌株在生防素毒力、组织病理学培养和加工工艺方面做了一些研究[9-10]，如：宋丽雯[9]研究证实顶孢霉菌株Ahy1对桃蚜、苜蓿斑蚜、豆无网长管蚜、粘虫和菜青虫均有较强的侵染力，尤其对桃蚜的毒力最强，最终累计死亡率为84.07%.其胞外蛋白酶和几丁质酶的分泌规律及活力与毒力之间存在显著的相关性；李莉等[10]初步研究了营养物质、碳氮比、不同培养时间与Ahy1生长发育的关系；张莉等[11]研究了Ahy1菌株的加工工艺，为该菌的工厂化生产奠定了基础；王琰等[12]研究了Ahy1对小菜蛾的毒力及体内保护酶活力的影响.

目前，有关该菌株是否会侵染农作物，对作物的安全性及生理指标的影响未见有报道.本研究通过测定顶孢霉菌株Ahy1对几种作物的致病性及生理指标的影响，明确该菌株对黄瓜、玉米、菜豆、小麦、茄子及辣椒等农作物的安全性，以期为开发对害虫侵染力高、对作物安全的顶孢霉Ahy1菌株微生物杀虫剂奠定基础.

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试作物黄瓜(‘绿宝’)、玉米(‘郑单958’)、菜豆(‘无筋架豆王’)、小麦(‘中植3号’)、茄子(‘兰杂2号’)、辣椒(‘九寸红’)，上述作物种子均由甘肃省绿星种子公司提供.

1.1.2供试菌株顶孢霉(A.hansfordii)菌株Ahy1由甘肃农业大学草业学院农药实验室提供，经纯化保存于4 ℃冰箱中，每2月转接1次.

1.2试验方法

1.2.1顶孢霉菌株孢子悬浮液的制备用PDA平板培养顶孢霉菌株，挑取适量菌落放入SDAY培养液[11]，置于恒温振荡仪中，转速120 r/min，温度25 ℃振荡培养72 h[13].然后，用纱布过滤制孢子悬浮液，并用血球计数板计数，调节孢子悬浮液浓度至1×107个孢子/mL.

1.2.2顶孢霉菌株对黄瓜和小麦种子萌发、根长及生化指标的影响采用滤纸萌发法培养[14-15].黄瓜和小麦种子用75%的酒精消毒5 min，经蒸馏水冲洗数次后，50 ℃温水浸泡48 h，然后用滤纸吸干，挑选健康而饱满的种子置于铺有2层定性滤纸的培养皿(直径为9 cm)中，将顶孢霉孢子悬浮液稀释为5×106、1×106、5×105、2×105、1×105、2×104、1×104个孢子/mL 6个浓度，每个处理分别取10 mL加入相应的培养皿中，然后分别放入10粒黄瓜和小麦种子，以蒸馏水为对照，重复3次.将培养皿置于光照培养箱中培养，温度25 ℃，湿度60%～70%.待对照种子全部萌发时，分别检查各处理种子萌发数和种子根长，分别计算种子萌发率，测量根长度.

待对照组黄瓜和小麦种子全部萌发时，收集上述经检查过的萌发种子(包括其芽和根)，用蒸馏水冲洗两次，测定生化指标.可溶性蛋白(Pro)含量测定采用考马斯亮蓝法[16]；过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[16]；过氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法[16]；过氧化氢酶(CAT)活性测定采用分光光度法[16].

1.2.3顶孢霉菌株对供试作物幼苗生长的影响选取健康、籽粒饱满的黄瓜、玉米、菜豆、小麦、茄子、辣椒种子，温汤浸种催芽后，播种于塑料花盆(直径14 cm,高度11 cm)内，小麦每盆播种20粒种子，其他5种作物每盆播种10粒种子；待苗高10 cm后，剔除长势较弱的幼苗，小麦每盆留10株，其他5种作物每盆留5株.采用喷雾法[17]，将孢子浓度为1×107个/mL的顶孢霉悬浮液稀释为5×106、1×106、5×105、2×105、1×105个孢子/mL后分别喷施黄瓜、玉米、菜豆、小麦、茄子和辣椒幼苗，以清水为对照，重复3次.喷施后将花盆置于光照培养箱中25 ℃、相对湿度75%，光照/黑暗(L/D)处理12 h/12 h.分别在处理7、14、21 d时，每个处理分别选取5株幼苗测株高、鲜质量、干质量，计算相对抑制率(%)，并观察植物的发病情况(是否有病斑、病斑大小、病斑颜色)及植物叶片生长情况.

1.2.4数据分析所有试验数据应用DPS(7.05)软件，Duncan新复极差法进行差异显著性检验.

2结果与分析

2.1顶孢霉菌株对黄瓜和小麦种子各生理、生化指标的影响

2.1.1顶孢霉菌株对黄瓜和小麦种子萌发及根生长的影响由表1可知，Ahy1孢子悬浮液在高浓度下对黄瓜种子萌发和根长生长有轻微的抑制作用，随浓度降低抑制作用减弱.Ahy1孢子悬浮液在5×106、1×106、2×105个孢子/mL浓度下，对黄瓜种子萌发相对抑制率分别为25.56%、11.11%、7.41%，对黄瓜根长的相对抑制率分别为32.29%、20.18%和18.39%.Ahy1孢子悬浮液在2×104、1×104个孢子/mL浓度下，对黄瓜种子萌发相对抑制率分别为-8.64%、-11.11%，对黄瓜根长的相对抑制率分别为-0.90%、-8.07%，表现为促生作用.

Ahy1孢子悬浮液6个浓度下对小麦种子萌发的影响不明显，在5×106、1×105个孢子/mL浓度下相对萌发抑制率为7.00%和6.00%，其他4个浓度与对照差异不显著.对小麦根长生长表现出高浓度的抑制作用和低浓度的促生作用，在5×106、1×106、2×105个孢子/mL浓度下，对根长的相对抑制率分别为38.30%、31.92%和6.74%，表现抑制作用；在2×104、1×104个孢子/mL浓度下，小麦根长的相对抑制率分别为-2.48%和-8.87%，表现为促生作用.

表1　Ahy1孢子悬浮液对黄瓜和小麦萌发及根长的影响

同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著.

2.1.2顶孢霉菌株对黄瓜和小麦种子各生化指标的影响由表2可知，Ahy1孢子悬浮液6个浓度对黄瓜种子中Pro含量影响不明显(平均相对抑制率为3.14%)，但对SOD、POD影响显著，其平均相对抑制率分别为-82.51%和-35.96%，表现为促进作用，对CAT有明显的抑制作用，平均相对抑制率为20.51%；对小麦种子中可溶性蛋白(Pro)、过氧化物酶(POD)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)含量有显著的影响，其平均相对抑制率分别为-2.05%、-18.07%、-23.31%和-34.33%，表现为明显的促进作用.

表2　Ahy1孢子悬浮液对黄瓜和小麦种子生化指标的影响

同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著.

2.2顶孢霉菌株对供试作物生长的影响

由图1可看出，Ahy1菌株不同浓度孢子悬浮液处理黄瓜、玉米、菜豆、小麦、茄子及辣椒的幼苗21 d后，均未见任何发病症状，植株生长正常，与对照无显著差异.顶孢霉菌株未侵染供试作物，对供试作物生长没有明显可见影响.

2.2.1顶孢霉菌株对供试作物株高的影响由表3可知，顶孢霉5×106、1×106、5×105、2×105、1×105个孢子/mL 5个浓度处理6种供试作物7 d后，对株高均有不同程度的促进作用，菜豆、玉米促进作用最明显，其平均抑制率分别为-18.62%、-11.11%，与对照差异显著；其次是辣椒、茄子和黄瓜，平均抑制率分别为-8.56%、-6.61%和-1.71%.顶孢霉菌株对供试作物无影响，并表现促生作用.

2.2.2顶孢霉菌株对供试作物鲜质量的影响由表4可知，Ahy1不同浓度对6种供试作物的鲜质量均有不同程度的影响，处理7 d后，对菜豆、小麦幼苗鲜质量有明显的促进作用，其相对抑制率分别为-21.10%、-14.29%，与对照差异显著；其次对辣椒、茄子和黄瓜幼苗鲜质量有轻微的促进作用，其抑制率分别为-5.71%、-2.00%和-1.10%；对玉米幼苗的鲜质量略有抑制作用，相对抑制率为2.65%，与对照差异不显著.

A：黄瓜Ahy1处理；B：黄瓜清水对照处理；C：玉米Ahy1处理；D：玉米清水对照处理；E：菜豆Ahy1处理；F：菜豆清水对照处理；G：小麦Ahy1处理；H：小麦清水对照处理；I：茄子Ahy1处理；J：茄子清水对照处理；K：辣椒Ahy1处理；L：辣椒清水对照处理.图1　Ahy1孢子悬浮液对6种作物幼苗生长的影响Fig.1　Effect of Ahy1 spores suspension on seedlings’ growth of six crops

顶孢霉处理/(个孢子·mL-1)黄瓜株高/cm相对抑制率/%玉米株高/cm相对抑制率/%菜豆株高/cm相对抑制率/%CK13.54±0.65a-8.55±2.09a-22.60±3.76b-5×10613.35±1.47a1.429.04±1.57a-5.7326.78±3.65ab-18.501×10614.36±0.85a-6.039.92±1.87a-16.0224.53±1.81ab-8.545×10513.54±1.97a-0.029.96±0.65a-16.4927.88±3.53a-23.362×10514.50±1.77a-7.069.68±1.42a-13.2227.43±3.55a-21.371×10513.12±1.50a3.128.20±0.94a-4.0927.42±2.34a-21.33平均抑制率%-1.71-11.11-18.62顶孢霉处理/(个孢子·mL-1)小麦株高/cm相对抑制率/%茄子株高/cm相对抑制率/%辣菽株高/cm相对抑制率/%CK22.20±3.62a-5.2±0.68ab-3.97±0.47a-5×10625.21±4.91a-13.555.51±0.60ab-4.754.15±0.72a-4.531×10624.45±4.54a-10.145.95±0.49a-13.114.52±0.60a-13.855×10523.69±7.08a-6.714.93±0.80b6.274.30±0.45a-8.312×10523.43±5.63a-5.545.34±0.59ab-1.524.46±0.78a-12.341×10523.23±3.72a-4.644.87±0.73b7.414.12±0.56a-3.78平均抑制率%-8.12-6.61-8.56

同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

表4　Ahy1孢子悬浮液对6种作物幼苗鲜质量的影响

同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

2.2.3顶孢霉菌株对供试作物干质量的影响由表5可知，Ahy1 5个浓度处理6种供试作物7 d后，对黄瓜和玉米的干质量有抑制作用，其抑制率分别为15.10%和6.21%；对辣椒、菜豆、茄子和小麦的干质量有促进作用，其抑制率分别为-16.41%、-15.59%、-15.10%和-9.50%；与对照差异不显著.

表5　Ahy1孢子悬浮液对6种作物幼苗干质量的影响

同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05).

3讨论

本研究结果表明，在25 ℃，相对湿度75%条件下，Ahy1菌株不同浓度的悬浮液对6种供试作物处理7 d后，对大部分幼苗的株高、鲜质量和干质量有不同程度的促生作用，对玉米幼苗的鲜质量和黄瓜及玉米幼苗的干质量有抑制作用.Ahy1菌株不同浓度孢子悬浮液处理供试作物21 d后，均未见任何发病症状，植株生长正常，对供试作物生长没有明显可见影响.

Ahy1孢子悬浮液6个浓度对黄瓜和小麦种子萌发和根长生长有轻微的抑制作用，随浓度降低抑制作用减弱，表现为促进作用，即整体上表现出高浓度抑制作用和低浓度促生作用.由于Ahy1菌株对蚜虫有较高的毒力(对甘蓝蚜的LC50为1.650× 106个孢子/mL)[9]，其代谢液中含有多种活性物质，这些物质中可能含有对植物生长有影响的成分.但从试验结果来看，这些前期的影响较为轻微，对作物生长后期的影响有待于进一步验证.

Ahy1孢子悬浮液6个浓度对小麦种子中可溶性蛋白(Pro)、过氧化物酶(POD)、过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)含量有显著的影响，其平均相对抑制率分别为-2.05%、-18.07%、-23.31%和-34.33%，表现为促进作用，这些酶是植株保护酶系统的重要组成部分，小麦在此条件下抗逆性增强；对黄瓜种子中SOD、POD表现为促进作用，相对抑制率分别为-82.51%和-35.96%，但对Pro、CAT有抑制作用，这可能是引起黄瓜幼苗干质量变化的原因.

顶孢霉菌株Ahy1孢子悬浮液对作物生长后期的影响作用及对黄瓜种子中CAT活性的抑制作用有待于进一步研究验证.

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(责任编辑胡文忠)

Effect ofAcremoniumhansfordiispores suspension on germination and growth of several crops seedling

HAO Yu,YANG Shun-yi,ZHANG Xin-hu,SHEN Hui-min,YUE Xiu-li,LUO Ling-yan

(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University,Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Education Ministry,Sino-U.S.Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 The effects ofAcremoniumhansfordii(Ahy1) spores suspension were studied on seed germination and seedling growth of several crops.【Method】 Indoor biological tests and physiological and biochemical analysis were conducted on cucumbers,corns,beans,wheat,eggplant and peppers.【Result】 Ahy1 spores suspension at six concentrations showed promotion at high concentrations and inhibition at low concentrations on germination and root length of wheat and cucumber.Ahy1 differently promoted protein (Pro) content,activity of peroxidase (POD),superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in wheat seeds.Ahy1 spores suspension increased activity of SOD and POD in cucumber seeds,the inhibition rates were -82.51% and -35.96%.Ahy1 had significant inhibition to CAT activity,and no significant effect to Pro content.The average inhibition rates of Ahy1 to plant height of the six crops were -18.62%,-16.22%,-11.11%,-8.56%,-6.61% and -1.71%;and that were -21.10% and -14.29% to fresh weight of bean and wheat，that were -16.41%,-15.59%,-15.10% and -9.50% to the dry weight of peppers,beans,eggplant and wheat.These results indicated promoting effect of Ahy1,but inhibition to dry weight of cucumbers and corn.【Conclusion】 The tested crops were treated by Ahy1 spores suspension at six concentrations for 21 days,no significant disorders were found on plant growth.

Key words：A.hansfordiispores suspension;seedling height;fresh weight;dry weight;seed germination rate;root growth;physiological indicators

通信作者：张新虎，男，教授，博士生导师，主要研究方向为农业昆虫学及生物农药的开发与应用.E-mail：ndzxh@gsau.edu.cn

基金项目：甘肃省科技支撑计划项目(1204NKCA073).

收稿日期：2015-01-21；修回日期：2015-04-01

中图分类号：S 763.306

文献标志码：A

文章编号：1003-4315(2016)03-0095-07

第一作者：郝雨(1988-) ，男，硕士研究生，研究方向微生物制剂的开发与应用.E-mail：haoyu3210@sina.com