PRM2 G398C多态性与386例汉族男性生育力的相关性研究*

李　俊，刘　芳，杨雪梅，宋亚曼，冯艳萍，谭宇哲

(河北医科大学第一医院生殖医学科　050031)



PRM2 G398C多态性与386例汉族男性生育力的相关性研究*

李俊，刘芳，杨雪梅△，宋亚曼，冯艳萍，谭宇哲

(河北医科大学第一医院生殖医学科050031)

[摘要]目的研究鱼精蛋白2(PRM2)基因 G398C多态性与汉族男性生育力的相关性。方法选取386例原发不育男性患者为观察组，255例生育男性为对照组，分别分析两组常规精液参数及DNA 完整性、核蛋白成熟度等精子功能参数，采用DNA测序技术对PRM2 G398C位点进行基因分型，统计该多态性位点与男性不育发病率的关系。结果不育患者 PRM2 G398C位点CC基因型频率(11.92%)高于生育男性(6.67%)，分析显示CC基因型与男性不育的遗传易感性明显相关(OR=2.002，95%CI=1.097～3.653，P<0.05)。CC基因型可使精子DNA完整性、核蛋白成熟度等精子功能参数明显下降，可能是其导致男性不育的主要因素。结论PRM2 G398C多态性改变与汉族男性生育力相关。

[关键词]鱼精蛋白2；多态性，单核苷酸；不育，男(雄)性；遗传易感性

国外不孕不育患者约占已婚夫妇的10%～15%，其中，由男性因素导致的不育比例达50%[1]。鱼精蛋白1(promatine1,PRM1)及鱼精蛋白2(promatine2,PRM2)是人类两种主要的鱼精蛋白，分别由位于16p13.3的PRM1、PRM2基因编码。鱼精蛋白在精子DNA凝聚及包装中发挥重要作用，是主要的DNA结合蛋白[2]。小鼠敲除PRM1或PRM2基因可导致单倍剂量不足、染色质凝聚异常、精子损伤及雄性不育[3]。报道指出鱼精蛋白基因编码区、非编码区的微小改变可导致其表达的完全异常[4]，进而影响男性生育力。G398C SNP位点位于PRM2基因的内含子区，目前尚未见其多态性改变与汉族男性生育力的相关性研究，本研究旨在分析PRM2 G398C多态性改变对汉族男性生育力的影响。

1资料与方法

1.1一般资料收集2013年8月至2014年8月，于本院生殖医学科就诊患者为研究对象。不育组为排除女方因素，未避孕大于或等于1年未育的男性患者，除外染色体异常及Y染色体微缺失患者。生育组(对照组)男性为未借助辅助生殖技术的已育查体患者255例。观察组包括386例不育患者。观察组与对照组精子浓度、活力、前向运动比例、精子形态等常规精液参数比较，差异无统计学差异意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1　不育与生育组男性常规精液参数比较±s)

1.2方法

1.2.1精液分析患者禁欲2～7 d手淫法无菌采集精液，按WHO标准[5]分析精液常规参数及精子形态，精子浓度、活力及前向运动精子比例采用计算机辅助分析方法。留取部分精液用于精子DNA完整性及核蛋白成熟度分析。精子核DNA完整性由染色质扩散实验试剂盒检测(深圳华康生物医学工程有限公司)，苯胺蓝染色法用于分析精子核蛋白成熟度(深圳博锐德生物科技有限公司)。

1.2.2PRM2基因型分析应用DNA提取试剂盒由精液标本分离DNA(北京康为世纪生物科技有限公司)，上游引物序列：5′-CCC ATG GCC AGT CTC ACT AT-3′，下游引物序列：5′-CCA GGT TTG TGT GAT TCG TG-3′，建立25.0 μL PCR反应体系，包括2.0 μL模板DNA，12.5 μL 高保真2×GoldStar Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)，上、下游引物各1.0 μL，双蒸水8.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物为641 bp，将扩增得到的PCR产物纯化(天根生化科技凝胶纯化试剂盒)后双向测序(上海英潍捷基公司)。

1.3统计学处理采用SPSS16.0统计软件进行分析，χ2检验用来检测SNP位点在检测人群中的分布是否符合哈迪-温伯格定律并检测基因型在观察组及对照组中的分布频率、关联比值比(OR)及95%CI，t检验用于比较观察组及对照组常规精液参数的差异，不同基因型间精子功能参数的比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1PRM2 G398C多态性与汉族男性生育力的相关性分析观察组及对照组男性中均可检测到3种基因型(图1)，且均符合哈迪-温伯格平衡定律。CC基因型在观察男性中的分布频率为11.92%(表2)，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；数据分析表明，CC基因型可增加男性不育症的发病风险(OR=2.002，95%CI:1.097～3.653，P<0.05)。

A:GG纯合型；B:GC杂合型；C:CC纯合型。

图1　PRM2 G398C基因型

*：野生型。

2.2G398C基因型对精子功能参数的影响精子DNA完整性及核蛋白成熟度的检测，3种基因型精子DNA完整性及核蛋白成熟度的比较，CC基因型精子DNA完整性及核蛋白成熟度比例均显著低于GG及GC基因型，差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3　PRM2 G398C基因型与精子功能参数的

3讨论

尽管男性不育诊断取得很大进步，仍不清楚30%原发不育患者的病因及发病机制。研究指出遗传学异常是男性不育的主要因素[6]。近年来多项研究探讨了鱼精蛋白基因多态性改变与男性不育的相关性，结果发现，不同SNP位点在不同种族人群中与不育的相关性不同。本文首次报道了PRM2 G398C多态性位点与汉族男性生育力的相关性，结果显示出CC基因型与男性不育患病率相关，与国外报道[7]不一致，可能是入选对象标准及人群遗传背景差异造成的。相关报道也显示，不同研究人群中PRM基因多态性与男性不育的相关性结果存在很大差异[8-10]，遗传背景差异可能是导致这一现象的最为重要的原因。由于单一多态性的低显性遗传效应通常取决于与其他多态性位点的相互作用及包括饮食、生活方式等在内的特定环境因素的综合影响，因此遗传变异的影响可能被其他尚未发现的致病因素所掩盖[1]。

精子发生过程中，核组蛋白由过渡蛋白取代，而后过渡蛋白又被鱼精蛋白取代，鱼精蛋白通过分子内及分子间的二硫键与小沟DNA紧密结合，使DNA包裹程度增加，染色质凝聚水平可达体细胞的6倍。人类精子表达两种类型的鱼精蛋白，即P1和P2，二者比例近似1∶1，其比例升高或降低均与男性不育相关。研究发现PRM1及PRM2基因及其相关调控区域的突变可影响鱼精蛋白表达，鱼精蛋白水平异常可导致染色质的不完全凝聚及父源DNA损伤[11]。由于核蛋白成熟度检测可评估精子染色质致密化，检测与核蛋白相关的染色质缺陷[12]，本实验通过对核蛋白成熟度及精子DNA完整性的检测评估G398C多态性改变对精子染色质凝聚的影响。

研究结果发现，CC基因型中精子DNA完整性及核蛋白成熟度比例明显降低，与报道指出的鱼精蛋白基因突变可导致精子发生及印迹基因异常，造成染色质损伤及DNA断裂的结论一致[2]。推测PRM2 G398C单核苷酸的改变可能导致精子细胞核中鱼精蛋白含量的异常，比例过高的组蛋白可阻碍鱼精蛋白与精子DNA的正常结合，影响DNA链折叠，降低精子DNA稳定性[13]，而精子核DNA完整性及核蛋白成熟度等精子功能指标是评估男性生育力的重要参数[14-15]，推测G398C多态性可通过改变鱼精蛋白表达，引起核蛋白成熟度及DNA完整性下降，造成生育力降低。

综上所述，PRM2 G398C多态性改变与汉族男性生育力相关。CC基因型可使精子DNA完整性及核蛋白成熟度显著降低，可能是导致男性不育的重要原因。

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Association study of PRM2 gene polymorphism with male infertility in the 386 Chinese Han population*

Li Jun,Liu Fang,Yang Xuemei△,Song Yaman,Feng Yanping,Tan Yuzhe

(DepartmentofReproductiveMedicine,theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050031,China)

[Abstract]ObjectiveTo determine the association of one single nucleotide polymorphism loci G398C in PRM2 with male infertility in Chinese Han population.MethodsA total of 386 infertile men were recruited as the observation group and 255 fertile men were recruited as the control group.Routine semen analysis as well as sperm functional parameters such as DNA integrity and nucleoprotein maturity rates were analyzed.Direct sequencing of G398C in PRM2 gene of infertile and fertile men was also conducted to evaluate the association of G398C SNP loci with male infertility.ResultsStatistical analysis showed that the frequencies of CC genotype of PRM2 G398C was significantly different between the infertile (11.92%) and fertile men (6.67%) and it was associated with increased risk of male infertility (OR=2.002,95%CI=1.097-3.653,P<0.05).Moreover,it was discovered that sperm DNA integrity as well as nucleoprotein maturity rate of CC genotype were dramatically decreased compared with other genotypes (P<0.05),which would probably lead to infertility.ConclusionOur results gave the first evidence that PRM2 G398C polymorphism was associated with male infertility in Chinese Han population.

[Key words]protamine 2;polymorphism,single nucleotide;infertility,male;genetic susceptibility

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.017

*基金项目：河北省人口和计划生育委员会指令课题(2013-A08)。

作者简介：李俊(1982-)，助理研究员，博士，主要从事人类辅助生殖实验室工作。△通讯作者，Tel:(0311)85917146;E-mail:meicherrymissyou@163.com。

[中图分类号]R698+2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)16-2215-02

(收稿日期：2015-12-23修回日期：2016-02-25)