一种改良的薄层等电聚焦电泳新方法

张 旭陈振江（ 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2 湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065）



一种改良的薄层等电聚焦电泳新方法

张 旭1陈振江2*
（1 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2 湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065）

【摘要】目的 介绍一种高效新颖的IFE方法。方法 采用簿层等电聚焦电泳。结果 该方法简便实用，并可节省昂贵试剂的用量。结论 此方法可用于药物蛋白质成分的研究。

【关键词】凝胶；聚丙烯酰胺凝胶电泳；十二烷基硫酸钠-PAGE；等电聚焦电泳

等电聚焦电泳（IFE）是将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。此外，由于分离所需时间短，分子扩散作用较小，分离结束后能回收被分离的样品物质，故在中药成分分析及中药材真伪鉴别上有着广泛而良好的应用前途。在进行IFE过程中，虽然分辨率会随电泳时间的延长和工作电压的升高而提高，但工作电压的升高也会使pH梯度衰变加快，需采用相应的技术措施来解决。

为降低pH梯度缓冲液在较高工作电压下的“衰变”，可采用如下措施：①选用适宜的两性电解质。理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导，以保证其稳定的pH梯度和允许一定的电流通过。两性电解质的分子量要尽可能小，以保证被分离的高分子物质通过分子筛或透析方法得以分开，同时所选用的电解质不应与被分离物质发生反应或使之变性。目前，普遍应用的两性电解质有3种规格，分别适用于pH 3～10、pH 4～10、pH 5～7。②调节阳极电解液的pH值以改变pH梯度。如在控制电解质本身的浓度时，通过加入离子型表面活性剂来增加电解液的导电性，以促进适宜的较“平坦”的pH梯度的形成。③用缓冲剂聚焦电泳可制备包含待分离样品中狭窄的等电点在内的水平pH梯度。如陈振江应用PAGE、SDS-PAGE及IFE系列电泳技术研究鉴别了青箱子、阿胶、菊花、射干、土鳖虫、山药、白术、半夏等中药[1-8]。此外，为了产生相应的pH梯度，将已聚合的胶放在由0.1 mol/L H3PO4和0.1 mol/L NaOH组成的电极液中预泳1 h，然后取紫苏子及其伪品荠荸子的样品液各10 μL，点于胶上电泳2 h。结果显示在靠近碱性、中性或酸性的各个区域，紫苏子与荠荸子的电泳谱带完全不同，实现了二者的鉴别[9]。实验中使用的两性电解质Ampholyte是一种脂肪族多胺基多羧基的混合物，一般为40%的水溶液，电聚焦的用量通常为1%～2%。试验表明，两性电解质用量小时，电聚焦后形成的pH梯度宽于其本身的pH梯度；相反，用量大时，电聚焦后形成的pH梯度近似其本身的pH梯度。因此，要提高分辨率，两性电解质的用量应仔细斟酌。此外，电聚焦的时间直接影响pH梯度的变化。时间过长或过短都不会产生平滑的曲线。所以，电聚焦的时间应严格控制，才能得到分辨率高的电泳图谱。一般电泳时间以6～7 h为宜。

为节省试剂用量，简化操作，同时有利于电泳图谱的保存，本文介绍由实验课题组自行设计的薄层等电聚焦电泳装置及其操作技术。

1 实验仪器与试剂

自行组装薄层等电聚焦电泳模板一套；230型精密pH计（美国奥立龙）；离心机；丙烯酰胺、磷酸、N-N亚甲基双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、过硫酸铵、乙二胺、pH 4～10两性电解质均为AR级试剂；水为三蒸水。

2 实验方法

2.1 制胶方法：凝胶母液及电极缓冲液的配制见表1。将凝胶以簿层（其厚度相当投影胶片的厚度）的形式，附着在玻璃片上，玻璃片的背面距长边1 cm处，用标记笔画一横线，作为上样基准线。

表1 聚丙烯酰胺凝胶的配方

2.2 上样方法：将定量滤纸剪成芝麻粒大小，装入干燥洁净是培养皿中。上样时用尖头镊子夹上一粒浸入样品液中，取出后放在凝胶的基准线上即可。在10 cm×5 cm的玻璃片上可上样12～25个样品。

2.3 加电极缓冲液的方法：由于簿层等电聚焦电泳需用的试剂量很小，所以电极缓冲液只需50～100 mL，装在滴瓶中，电泳过程中只需间断的将电极液滴到紧靠凝胶的滤纸条头即可。

2.4 电泳使用的电泳槽为两片厚1 cm的有机玻璃块（10 cm×5 cm），中间钻两个孔，用以装正负电极柱；在长的一边距边1 cm处开槽（10 cm× 0.2 cm），其边沿上铺设铂金丝。

2.5 实验装置见图1，最下方是一个30 cm×20 cm的搪瓷盘，内装冰块以消除电泳过程中产生的热；搪瓷盘上面是一块35 cm×25 cm的普通玻璃，玻璃上是一个硅胶垫片（中间是一个恰好与玻璃片大小相同的空格） 。

图1 簿层等电聚焦电泳装置

3 结果讨论

3.1 该方法简便实用，即可节省昂贵试剂的用量，又可在一块凝胶上作多品种药物的研究。所得电泳图谱即可长久保存，又可由电泳图谱鉴别药物真伪，同时可以测定药物所含主要蛋白质成分等电点。

3.2 在测定未知样品的等电点时，可先采用pH=3～10的两性电解质，在初步测出等电点之后，改用包括样品pI值的、窄pH范围的两性电解质。为形成平滑的pH梯度并节省两性电解质的用量，可将占载体总量10%的pH=5～8的两性电解质加入pH=3～10的两性电解质中，由此可提高分辨率。

3.3 电泳使用的玻璃片必须洁净，并用6 μL /100 mL硅酮溶液浸泡，晾干后制胶。这样做的目的在于防止电泳后凝胶片的变形和开裂。

参考文献

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[2] 陈振江,沈瑜琪,刘炎文.贵重动物类中药材蛋白质SDS-PAGE的图谱研究[J].中药材,2007,30(7):769.

[3] 陈振江,殷丹,曹艳.厚朴种子蛋白质成分分子量测定[J].中成药, 2005,27(6):711.

[4] 徐康森,杨仲元,詹华强,等.酒石酸锑及其中间体的纯度检查[J].药物分析杂志,1982,2(4):193.

[5] 陈振江,张香梅.中药青葙子、土鳖虫的等电聚焦电泳研究[J].中草药,1996,27(10):593.

[6] 陈振江,张桂枝,刘静芬,等.阿胶及其伪品的IFE研究[J].中成药, 1998,20(12):31.

[7] 陈振江,陈科力,王曦,等.金钱白花蛇可溶性蛋白凝胶电泳图谱的研究[J].中草药,2000,31(5):374.

[8] 陈振江,殷丹,干伟.姜黄素胶原微球的制备工艺研究[J].湖北中医学院学报,2008,10(1):38.

[9] 黄哲熙.中药材经验鉴别方法和应注意的问题[J].中草药,1993, 24(5):263.

中图分类号：R-33

文献标识码：B

文章编号：1671-8194（2016）09-0026-02

基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金项目（20122133120006），辽宁省自然基金项目（201202153），辽宁省教育厅一般项目（L2012350）

*通讯作者