酒精发酵过程中胁迫因子对酵母海藻糖积累的影响

许宏贤，周　鹏，王　欣，张晓萍，段　钢（杜邦工业生物应用科技部杰能科（中国）生物工程有限公司，江苏无锡214028）



酒精发酵过程中胁迫因子对酵母海藻糖积累的影响

许宏贤，周鹏，王欣，张晓萍，段钢
（杜邦工业生物应用科技部杰能科（中国）生物工程有限公司，江苏无锡214028）

摘要：针对酒精生产酵母可能面临的受迫性因子对海藻糖形成的影响进行了研究。结果表明，不同碳源如蔗糖、葡萄糖对酒精发酵液中海藻糖的含量几乎没有差别；黄曲霉毒素Afb1对酒精发酵海藻糖的累积有一定的影响；发酵起始pH值过高（6.5）或过低（3.5）都会导致发酵液中游离海藻糖含量/海藻糖总量增高，发酵起始pH值过低（3.5）还会导致酵母胞内海藻糖含量升高；发酵温度过高（38℃）会导致发酵液中游离海藻糖/胞内海藻糖/海藻糖总量升高；氮源不足会引起发酵液中海藻糖/胞内海藻糖/海藻糖总量显著升高，并且氮源对胞内海藻糖累积的影响远远大于温度。

关键词：海藻糖；碳源；pH值；毒素；温度；氮源；酒精

海藻糖是由2个吡喃型葡萄糖通过α，α-1，1-糖苷键连接而成的双糖，是一种稳定的非还原性双糖，广泛存在于藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫等动植物和微生物中。它既是一种贮藏性糖类，又是生物体抵御胁迫环境的应激代谢物，特性非常稳定，能够在高渗、高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下于细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

目前已知的微生物体内生物合成海藻糖的途径有3种［1］，见图1。其中OtsAB是酵母菌和大肠杆菌抵御胁迫环境最常规的合成途径。从UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸，之后经去磷酸化形成游离的海藻糖。该反应由海藻糖-6-磷酸合成酶（OtsA）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（OtsB）分别催化。

图1　　海藻糖在细菌体内生物合成途径

浓醪发酵是酒精生产的发展方向［2］。在高浓度发酵初期，高浓度底物（如葡萄糖）及后期逐渐积累的乙醇会对细胞产生毒害作用，影响发酵。海藻糖作为酵母受胁迫的指标性物质之一，国内外对其研究持续不断。早在1998年，史戈峰等［3］的研究就表明，当起始葡萄糖浓度达到24%，发酵时间为65～70 h时，酵母细胞内海藻糖可高达细胞干重的20%；乔长晟等［4］研究表明，加压有利于酵母菌胞内海藻糖质量分数的积累，并且酵母菌株应激产物海藻糖积累越高，其越有利于适应体外环境剧烈的改变，相应的酵母菌株对压力的敏感性越强，加压导致酵母菌形态变化越明显，反应体系中pH值降低是影响酵母菌活性的主要因素，由此可认为，高压条件下的CO2酸化作用是影响面包酵母海藻糖生成的主要因素。丁春磊［5］2014年研究了不同质量的原材料如粉状木薯、黄木薯、正常块状木薯，在发酵过程中，由于在一定程度上受到木薯原料质量影响，导致微生物发酵产生有害因子，对酵母代谢产生抑制作用，海藻糖含量增高。Hottiger等［6］的研究表明，热刺激可导致酵母大量积累海藻糖；Hounsa等［7］于1998年研究了渗透压对海藻糖积累的影响；Mahmud等［8-14］及众多学者研究了盐的因素对酵母积累海藻糖的影响。这些对酵母积累海藻糖抵抗恶劣环境作用及作用机理的研究有助于酒精工业的发展，然而工业化酒精生产过程中，酵母的受胁迫因子远不止于此，常见的因素汇总如图2［15］。由此可见除了醪液浓度、压力、原材料质量、温度、离子浓度之外，还有很多因素都会使酵母处于极端环境。为此本研究针对酒精生产酵母可能面临的受迫性因子如不同碳源、黄曲霉毒素、pH值、温度和氮源对海藻糖形成的影响进行了研究。

图2　　酵母所受胁迫性因子

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与培养基

酿酒高活性干酵母（耐高温型）：安琪酵母公司。

酒精发酵培养基（g/L）：碳源，葡萄糖200（或根据试验要求调节）；氮源，蛋白胨20，酵母粉10（或根据试验要求调节），pH5.5（根据试验要求调节）。

1.1.2实验材料

黄曲霉毒素标准品Afb1购于sigma；蛋白胨、酵母粉购于Oxford公司；葡萄糖、蔗糖、三氯乙酸等其他试剂均购于国药集团，木薯粉由国内某酒精厂提供；酶制剂SPEZYME ALPHA、DISTILLASE POWERSACC由杰能科（中国）生物工程有限公司提供。

1.1.3实验设备

ICS-5000型离子色谱，Dionex公司；高效液相色谱（1260型），Agilent公司；电子天平，梅特勒公司；离心机、水浴锅，赛默飞世尔科技公司。

1.2实验方法

1.2.1酒精发酵

取适量干酵母，加入适量无菌水，配制成1 g/L，室温活化20 min。每个250 mL三角瓶中装入150 mL培养基，加入活化酵母后32℃（或根据试验要求调节）静置发酵一定时间，发酵液用于分析。

1.2.2胞内海藻糖的提取

取一定体积的发酵液，在12000 r/ min条件下离心10 min，将沉淀的酵母细胞用蒸馏水洗涤3次，离心后用三氯乙酸萃取。

1.2.3海藻糖的测定

采用离子色谱测定发酵液及胞内海藻糖含量。Dionex，ICS-500型离子色谱。包括在线脱气装置的四元梯度泵GP50、电化学检测器ED50，Au为工作电极，Ag/ AgCl为参比电极，脉冲安培检测器工作参数E1 = 0.1V，t1 = 400 ms；E2 = 2V，t2 = 20 ms；E3 = 0.6V，t3 = 10 ms；E4 = 0.1V，t4 = 70 ms。CarboPakTM PA200色谱柱，流动相100 mmol/L NaOH，流速0.5 mL/min，柱温30℃，进样量25 μL。

1.2.4发酵液的分析

采用HPLC测定发酵液的组成成分。取0.5 mL发酵上清液，0.005 mol/L稀硫酸稀释10倍，过0.22 μm膜，Agilent 1260型HPLC，Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱，进样量20 μL，流动相0.005 mol/L稀硫酸，流速0.6 mL/min，柱温60℃；示差检测器。

2结果与讨论

2.1不同碳源（蔗糖、葡萄糖）对海藻糖形成的影响

蔗糖是酒精工业中使用范围仅次于葡萄糖的碳源，为此选取葡萄糖和蔗糖，分别配制不同浓度的培养基（100 g/L或200 g/L），离子色谱分析酒精发酵液中游离海藻糖的含量，结果见表1。

表1　不同碳源（蔗糖、葡萄糖）对海藻糖形成的影响

由表1可知，蔗糖、葡萄糖对酒精发酵液中海藻糖的形成的影响几乎没有差别，这大概是由于两者都是酵母可利用的碳源，并且浓度都没有达到使酵母受胁迫的程度所致。

2.2毒素（黄曲霉毒素Afb1）对海藻糖形成的影响（葡萄糖为底物）

黄曲霉毒素是陈化粮中最常见的毒素之一。近年来我国粮食年年丰收，某些地区出现相对过剩，库存量不断上升，由于气候、储存条件限制等种种原因，导致部分粮食受微生物污染，发霉变质，毒素水平超标从而无法食用，只能用于燃料乙醇生产。为此我们研究了毒素（黄曲霉毒素Afb1）对发酵液中游离海藻糖含量的影响，同时测定酵母胞内海藻糖含量，结果见表2。

表2　毒素（黄曲霉毒素Afb1）对海藻糖形成的影响

由表2可知，黄曲霉毒素Afb1对酒精发酵海藻糖形成有一定的影响，随着黄曲霉毒素Afb1升高，发酵液中的海藻糖（胞外）和酵母胞内的海藻糖含量都呈现出升高的趋势，毫无疑问黄曲霉毒素是酵母受迫性因素之一，酵母细胞通过调节自身海藻糖的合成来抵御它的伤害。

2.3发酵起始pH值对海藻糖形成的影响（葡萄糖为底物）

在酒精生产企业中［16］，由于传统、广泛使用的源自黑曲霉的糖化酶的最佳pH值为4.2～4.5，乳酸菌的生长在pH值低于5.0的情况下会受到抑制，这两方面因素使得绝大多数酒精厂在液化后通过加入硫酸调节发酵起始pH值，通常控制在4.0左右，有时为了控制或预防染菌，甚至会在3.5左右。为此我们研究了发酵起始pH值对酒精发酵和海藻糖形成的影响，用HPLC对发酵液成分进行分析，结果见表3；同时采用离子色谱分析酒精发酵液中游离海藻糖含量和酵母细胞内海藻糖含量，结果见表4。

由表3的HPLC结果来看，过低的起始pH值（3.5）会导致整个过程中反应体系的pH值都比较低，残余葡萄糖含量升高，发酵迟缓，最终酒度降低，另一个受迫性指标甘油的含量也随之上升。由表4可知，发酵起始pH值对酒精发酵海藻糖的形成有一定影响，发酵起始pH值过高（6.5）或过低（3.5）都会导致发酵液中游离海藻糖含量/海藻糖总量增高，发酵起始pH值过低（3.5）还会导致酵母胞内海藻糖含量升高，因此综合来看，酵母酒精发酵控制起始pH4.5～5.5比较合适。

表3　发酵不同起始pH值对发酵液成分的影响

2.4温度和氮源对海藻糖形成的影响（葡萄糖为底物）

高温是公认的导致酵母分泌积累海藻糖的主要因素之一，但是到目前为止鲜有氮源对酵母分泌积累海藻糖影响的报道，然而在浓醪发酵过程中，氮源无疑是酵母最主要的受迫性因素之一［17］，为此我们耦合温度这一因素，对不同氮源浓度对海藻糖形成的影响进行了研究。HPLC发酵液成分分析结果见表5，发酵过程中发酵液中游离海藻糖含量、胞内海藻糖含量、菌体量、发酵液海藻糖总量分别见图3—图6。

表5　发酵温度和不同氮源浓度对发酵液成分的影响（葡萄糖为底物）

图3　葡萄糖为底物温度和氮源对游离海藻糖的影响

由表5可知，氮源不足或发酵温度过高都会导致残余葡萄糖大幅增高，酒精度下降；图3揭示了发酵过程中海藻糖含量随温度和氮源浓度的不同而发生的变化，由此可见充足的氮源和适当的发酵温度是保证发酵液中游离海藻糖能够充分下降的必要条件；图4揭示了发酵过程中酵母胞内海藻糖的变化过程，氮源不足会导致发酵结束时胞内海藻糖含量大幅度增加，并且看起来氮源对胞内海藻糖累积的影响远远大于温度，这是始料未及的结果；图5揭示了发酵过程中菌体量的变化，高温会导致菌体量大幅度减少；图6表征了温度和氮源对总的海藻糖含量的影响，若想海藻糖维持在较低水平，温度和氮源都必须符合酵母的要求，任何一个条件不满足都会导致最终总的海藻糖含量大幅度升高；比较图6和图3可知，总海藻糖量的变化趋势与游离海藻糖量的接近。

图4　葡萄糖为底物温度和氮源对胞内海藻糖的影响

图5　葡萄糖为底物温度和氮源对菌体量的影响

图6　葡萄糖为底物温度和氮源对总的海藻糖含量的影响

高热环境在许多方面危及细胞，最主要的是造成膜的不完整以及使得蛋白质变性与凝结。细胞暴露在高热中造成蛋白质凝结，最终死亡。Mike［18］以及其他学者［19-20］认为海藻糖在酵母细胞遭受热冲击时起了稳定蛋白的作用。最近又发现海藻糖也能抑制变性蛋白的凝结，维持他们的部分折叠状态，在此状态下，蛋白质可被分子伴随物重新激活，但是海藻糖的继续存在将影响蛋白的重新折叠。笔者推测氮源不足导致的胞内海藻糖大幅度累积也许与此有关。

酵母体内除了存在与海藻糖生物合成有关的海藻糖-6-磷酸合成酶（OtsA）和海藻糖-6-磷酸磷酸酶（OtsB）之外，还存在中性海藻糖酶（NTH）和酸性海藻糖酶（ATH）［21］。NTH的pH值活性范围在6.7～7.0；ATH的pH值在4.0～5.0；ATH和NTH在酵母的生命周期显示相反的活力模式。NTH的活性在酵母的指数生长期高，而当细胞进入呼吸和稳定期时迅速衰减；与此相反，ATH的活性仅在细胞进入呼吸或/和稳定期或生长在呼吸底物如乙醇或甘油上时才能检出。因此，ATH活性对应的酵母生命周期是其产物、海藻糖已经累积到相当可观的水平的阶段；而NTH仅在指数生长期即海藻糖水平很低时有活性。酵母的不同生命阶段这两个海藻糖酶是如何进行功能协调的尚不为人知。但毫无疑问酵母体内海藻糖合成酶系的活力变化和海藻糖酶系的活力变化共同导致了发酵期间游离海藻糖、胞内海藻糖含量的变化。

2.5温度和氮源对海藻糖形成的影响（木薯粉为底物）

鉴于2.4的研究是用葡萄糖做底物，而实际生产多采用淀粉质原料边糖化边发酵工艺，故采用淀粉质原料中蛋白质含量相对较少的木薯粉进行验证，具体的实验条件为：木薯粉浆浓度30%，pH值调节5.6，液化酶SPEZYME ALPHA，添加量0.2 kg/MT；85℃维持120 min；液化结束后不调节pH值，冷却至室温添加糖化酶DISTILLASE POWERSACC，添加量0.8 kg/MT；氮源采用不同浓度的尿素，接入酵母后在不同温度下进行发酵。HPLC发酵液分析结果见表6，发酵过程中发酵液中游离海藻糖含量的变化见图7。

表6　发酵温度和不同氮源浓度对发酵液成分的影响（木薯粉为底物）

比较表5和表6可知，采用木薯粉作原料得到了和葡萄糖做原料类似的结果，氮源不足或温度过高都会导致残余葡萄糖大幅增高，酒度下降；比较图3和图7可知，与葡萄糖为原料相一致，充足的氮源和适当的发酵温度是保证发酵液中游离海藻糖含量能够充分下降的必要条件；发酵过程中游离海藻糖的变化木薯粉原料和葡萄糖原料不完全一致，笔者认为这是由于原料不同，导致酵母体内海藻糖合成酶系的活力和海藻糖酶系的活力有所不同所致。

图7　木薯粉为底物温度和氮源对游离海藻糖的影响

3　展望

高浓度发酵近年来成为发酵工业的重要研究方向之一。过去十几年美国酒精业已经完成了从普通发酵（12%vol～15%vol）到浓醪发酵（16%vol～19%vol）的转型［22］。酵母在浓醪条件下的受胁迫因子更具挑战性。海藻糖是酵母受胁迫的指标性物质之一，由于外源性的海藻糖酶可以把发酵液中的游离海藻糖水解成葡萄糖从而被酵母利用提高酒精产出，故发酵液中海藻糖含量的研究对进一步提高酒精发酵水平具有指导意义。

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中图分类号：TS262.2；TS261.1；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0065-05

收稿日期：2016-02-23； 2016-04-01

作者简介：许宏贤（1970-）女，江苏无锡人，工学硕士，高级研究员，主要从事食品与发酵的研究，E-mail：sophia.xu@dupont.com。

通讯作者：段钢（1966-），男，辽宁沈阳人，工学博士，亚太地区技术总监，主要从事工业酶应用与开发，E-mail：gang.duan@dupont.com。优先数字出版时间：2016-04-06；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160406.1454.001.html。

DOI：10.13746/j.njkj.2016060

Effects of Stress Factors on Trehalose Accumulation in the Process of Ethanol Fermentation

XU Hongxian，ZHOU Peng，WANG Xin，ZHANG Xiaoping and DUAN Gang
（DuPont Industrial Biosciences，Genencor（China）Bio-product Co. Ltd.，Wuxi，Jiangsu 214028，China）

Abstract：The effects of stress factors on trehalose accumulation in the process of ethanol fermentation were explored. The results showed that，there was almost no difference in the effects of different carbon sources such as glucose and sucrose on the content of trehalose；there was a little effects of aflatoxin Afb1 on trehalose accumulation；extreme pH values，such as too high pH（6.5）or too low pH（3.5），would lead to higher in vitro trehalose and total trehalose in the fermentation broth，while too low pH（3.5）might also lead to higher in vivo trehalose；higher fermentation temperature（38℃）might result in higher trehalose content both in vitro and in vivo（which meant higher total trehalose accumulation）；insufficient nitrogen source might lead to remarkable higher in vitro/ in vivo/total trehalose accumulation（reported for the first time），and it seemed that nitrogen source played a more important role than temperature.

Key words：trehalose；carbon source；pH；aflatoxin；temperature；nitrogen source；ethanol