他莫西芬对大鼠血清雌孕激素及子宫雌孕激素受体的影响

张　玫，袁本利，吕艳文

(1.解放军第463医院 妇产科，辽宁 沈阳 110042； 2.军事医学科学院 毒物药物研究所，北京 100850)



他莫西芬对大鼠血清雌孕激素及子宫雌孕激素受体的影响

张玫1，袁本利2，吕艳文1

(1.解放军第463医院 妇产科，辽宁 沈阳 110042； 2.军事医学科学院 毒物药物研究所，北京 100850)

[摘要]目的探讨他莫西芬(tamoxifen,TAM)对大鼠血清雌、孕激素分泌水平以及对大鼠子宫雌、孕激素受体(ERα、ERβ、PR)表达状况的影响。方法40只成年雌性SD大鼠随机分为4组：假手术组(SHAM组)、假手术+TAM组(SHAM+TAM组)、去势手术组(OVX组)、去势手术+TAM组(OVX+TAM组)，每组10只。假手术组在找到卵巢后即分层缝合，关闭腹腔；去势手术组切除双侧卵巢建立OVX动物模型。SHAM+TAM和OVX+TAM组每日灌胃TAM；SHAM和OVX组给予等量蒸馏水，连续给药28 d。给药前后应用放射免疫分析法检测血清雌、孕激素分泌水平，实验结束处死大鼠取子宫，称量子宫重量，计算子宫系数，Western blot方法检测子宫的ERα，ERβ和PR的表达水平。结果与SHAM组相比，SHAM+TAM组大鼠子宫湿重显著降低(P<0.01)，子宫系数降低了47%。与OVX组相比，OVX+TAM组大鼠子宫湿重显著增加(P<0.05)，子宫系数是OVX组的1.87倍。SHAM+TAM组雌激素和孕激素水平均显著低于SHAM组，P<0.05。OVX+TAM组雌激素水平显著高于OVX组，而孕激素水平则极显著低于OVX组。与OVX组相比，OVX+TAM组ERβ的表达显著降低(P<0.05)，SHAM组PR的表达量显著降低(P<0.05)。OVX+TAM组的PR水平显著高于OVX组(P<0.05)，并与SHAM组水平相当(P>0.05)。结论TAM在不同雌激素水平条件下，对性激素分泌的影响是不同的。TAM在大鼠子宫内膜有雌激素样作用。TAM导致子宫内膜病变的机制可能与其雌激素样作用以及对性激素受体的调节有关。

[关键词]他莫西芬；子宫内膜；雌激素受体；孕激素受体

[引用本文]张玫，袁本利，吕艳文.他莫西芬对大鼠血清雌孕激素及子宫雌孕激素受体的影响[J].大连医科大学学报，2016,38(1)：28-31，36.

他莫西芬(tamoxifen, TAM)是第一代选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator, SERM),在乳腺癌综合治疗中具有重要地位，是目前临床上应用最广泛、最有效的内分泌治疗药物，也是乳腺癌术后辅助治疗的常用药物，近来还用于预防高危人群乳腺癌的发生。自Killachey等[1]首次报告TAM治疗的乳腺癌病人发生子宫内膜癌以来，陆续有他莫西芬增加子宫内膜癌发病率的报道。1996年IARC(WHO)已经把他莫西芬定位为致癌物。他莫西芬对子宫内膜的影响日益引起人们的关注。本文以雌性SD大鼠为研究对象，观察他莫西芬对去势和未去势大鼠血清雌、孕激素分泌水平以及子宫内膜雌、孕激素受体表达状况的影响，探讨他莫西芬在雌激素水平不同时对子宫内膜的影响，为临床上更安全的使用他莫西芬提供理论指导。

1材料和方法

1.1研究对象

1.1.1实验动物及分组：成年未交配健康雌性SD大鼠40只，由军事医学科学院实验动物中心提供，体重180～220 g。实验期间所有动物置于同一室内，SPF级环境分笼饲养，由北京药物安全评价中心动物室专人负责饲养，自由进食、饮水，室温(21±4 ℃)，光照12 h，黑暗12 h。将大鼠随机分为4组(每组10只)，分为：假手术组(SHAM)、假手术+TAM组(SHAM+TAM)、去势手术组(OVX)、去势手术+TAM组(OVX+TAM)。

1.1.2动物模型的建立：大鼠适应性喂养1周后，以5%戊巴比妥钠0.1 mL/kg行腹腔麻醉，打开腹腔完整切除双侧卵巢，即建立OVX去势动物模型，假手术组则在找到卵巢后即分层缝合，关闭腹腔。术后2周起，各组开始第1次给药，他莫西芬TAM(上海医药有限公司华联制药厂)，用蒸馏水配制成5 mg/mL的混悬液。给药剂量为50 mg/kg·d，其中SHAM+TAM和OVX+TAM组每日灌胃给药TAM，SHAM和OVX组给予等量蒸馏水。第1次给药前球后静脉采血，3000 g离心10 min分离血清，-20 ℃冻存留测雌激素。连续给药4周后，同样麻醉条件下，仰卧位固定大鼠，剖取子宫，精密称量，并计算子宫重量系数(子宫重量/体重)。取子宫组织，用生理盐水冲洗后迅速保存于液氮中，供提取总蛋白并进行ERα，ERβ和PR的Western blot检测。股动脉取血，同样条件分离血清冻存留测雌激素和孕激素。

1.2检测方法

1.2.1雌、孕激素检测：雌二醇放射免疫分析药盒和孕酮放射免疫分析药盒购于天津协和医药科技有限公司。由解放军总医院东亚放免所按试剂盒说明书操作测定。简要操作步骤为如下。加样前所有试剂充分摇匀，并且平衡到室温。取圆底聚苯乙烯试管若干，用记号笔分别事先编号，包括标准品管和待测样品管，然后用微量加样器按不同管体积要求分别按顺序加入去离子水、标准品/待测样品、125I-P、抗-E2抗体。加样后充分混匀，置37 ℃水浴1.5 h。加入分离试剂，充分摇匀，3600 r/min离心20 min，吸弃上清液。用γ-测量仪器测定各沉淀管的放射性计数。数据处理计算结果。

1.2.2ERα,ERβ和PR的Western blot检测：取出液氮中保存的子宫组织常规提取蛋白，采用BCA试剂盒测定上清液总蛋白浓度。根据3种蛋白的分子量分别制备10%和8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量80 μg,常规电泳、转膜、封闭。多克隆兔抗ERα及多克隆兔抗ERβ抗体(原液1∶500稀释，santa cruze公司)，多克隆兔抗PR抗体(原液1∶1000稀释，NeoMarkers公司)一抗4 ℃孵育8 h,HRP标记羊抗兔二抗(原液稀释1∶6000, 北京中杉生物制剂公司)37 ℃孵育1 h, 辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法显色(BCA试剂盒、发光液购于北京普利莱基因技术有限公司)。

1.3统计学方法

2结果

2.1子宫湿重及脏器系数

OVX组子宫系数较SHAM组降低76%。与SHAM组相比，SHAM+TAM组大鼠子宫湿重显著降低(P<0.01)，子宫系数降低了47%。与OVX组相比，OVX+TAM组大鼠子宫湿重显著增加(P<0.05)，子宫系数是OVX组的1.87倍。见表1。

表1　他莫西芬对大鼠子宫湿重及脏器系数的影响

1)与SHAM相比，P<0.01；2)与OVX相比，P<0.05；3)与OVX相比，P<0.01

2.2给药前后雌激素水平和给药后雌孕激素水平

给药前，OVX组和OVX+TAM组大鼠的血清雌激素水平显著低于SHAM组和SHAM+TAM组。给药后，SHAM+TAM组雌激素水平(2.32±0.13)pg/mL，显著低于SHAM组的(3.73±0.45)pg/mL，P<0.05；SHAM+TAM组孕激素水平(10.93±2.13)pg/mL也显著低于SHAM组(80.33±29.27)pg/mL，P<0.05。OVX+TAM组的雌激素水平(1.88±0.51)pg/mL显著高于OVX组(0.69±0.30)pg/mL，孕激素水平(6.39±0.47)pg/mL则极显著低于OVX组的孕激素水平(11.97±1.48)pg/mL。见表2。

表2　他莫西芬对大鼠血清雌孕激素水平的影响

1)与SHAM组相比，P<0.05；2)与SHAM+TAM组相比，P<0.05；3)与OVX组相比，P<0.05；4)与OVX组相比，P<0.01

2.3子宫内膜雌孕激素受体表达情况

Western blot结果显示，ERα在各处理组中均呈现明显阳性表达，各处理组之间差异无显著性意义。与SHAM组相比，SHAM+TAM组中ERβ的表达降低，但差异无显著性意义(P>0.05)。与OVX组相比，OVX+TAM组ERβ的表达显著降低(P<0.05)，SHAM组PR的表达量显著降低(P<0.05)。与SHAM组相比，SHAM+TAM组中PR的表达增强，但差异无显著性意义(P>0.05)；OVX+TAM组的PR水平显著高于OVX组(P<0.05)，并且与SHAM组水平相当(P>0.05)。见图1。

图1　雌激素受体ERα，ERβ和孕激素受体PR的Western blot检测结果及统计分析图Fig 1 The Western blot and statistical analysis results of ERα, ERβ, and PRA:Western blot 检测结果；B:统计分析图。*与OVX组相比，P<0.05；**与SHAM组相比，P<0.05

3讨论

他莫西芬为人工合成非甾体类选择性雌激素受体调节剂。他莫西芬具有双向调节作用，在同为雌激素受体的不同靶器官中具有不同的调节功能，如在乳腺组织中表现出雌激素拮抗作用，而对于子宫内膜却表现出雌激素激动作用。

子宫湿重和子宫系数是衡量子宫变化的基本指标。本实验结果显示，OVX组动物子宫系数较SHAM组降低76 %，雌激素水平也降低50 %以上，子宫呈明显萎缩状态，说明去势手术成功。他莫西芬能降低SHAM组大鼠子宫湿重和子宫系数，同时可以显著增加OVX组大鼠子宫湿重和子宫系数，提示了他莫西芬在雌激素分泌正常的大鼠体内抑制了子宫的生长，而在因去势而导致雌激素分泌受阻的大鼠体内，却可以刺激子宫的生长。他莫西芬可以降低SHAM组大鼠血清雌激素水平，表现为拮抗作用，增加OVX组大鼠血清雌激素水平，表现为激动作用。这说明机体在不同雌激素水平时他莫西芬的作用是不同的。在雌激素水平低下时可以增加雌激素水平，对子宫内膜呈雌激素激动作用。在实验中还发现他莫西芬可以增加OVX组大鼠肾上腺重量和肾上腺系数，他莫西芬可能通过旁路合成作用增加去势大鼠血清雌激素水平。在雌激素水平较高时，他莫西芬却可以降低雌激素水平，对子宫内膜呈雌激素拮抗作用。他莫西芬可以明显降低血清中孕激素的水平。孕激素起到对抗雌激素作用，子宫内膜长期受到无孕激素对抗的雌激素作用将导致子宫内膜的增生，最终可能发展为内膜癌。他莫西芬所致使的孕激素的下降可能造成单一的雌激素作用，在子宫内膜病变中起到一定作用。

雌激素受体β亚型近些年才被分离出来，其与经典的雌激素受体α亚型在机构、功能以及器官分布均有差异[2]。Andrea Morani在学术讲座中曾指出雌激素与ERα结合促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，而雌激素与ERβ结合则是抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡，雌激素通过与该两种受体的结合在细胞分化过程中起重要的双向调控作用。他莫西芬导致子宫内膜病变的原因一直是研究的焦点，有学者认为其导致子宫内膜病变是其在子宫上表现为雌激素样作用,也有人研究表明其有基因毒性,可以和DNA发生交联导致癌变。表观遗传学研究表明，他莫西芬可以降低增殖基因的甲基化水平，导致基因转录能力的改变。目前，对于他莫西芬对子宫雌激素受体亚型的影响鲜有报道。本实验结果显示他莫西芬可以降低大鼠子宫内膜ERβ的表达，尤其是去势大鼠，而对ERα无明显影响。说明他莫西芬对子宫内膜的影响可能与其降低ERβ有关。有文献报道他莫西芬能降低ERα的表达[3]。也有文献报道ERα和ERβ均参与他莫西芬促进子宫内膜癌细胞生长的作用[4]。本实验结果还显示他莫西芬可以明显提高大鼠子宫内膜PR的表达。有报道他莫西芬可以增加绝经后子宫内膜PR的表达[5]。这与文献报道的他莫西芬对绝经期乳腺癌妇女子宫内膜作用有一致性[6]。已知PR为雌激素调节蛋白[7],PR的表达被认为是雌激素刺激功能型ER产生的，雌激素在体内和体外均能增加PR的表达，PR的高表达证实了他莫西芬对大鼠子宫内膜有雌激素样作用。PR表达的增高也是孕激素水平降低的代偿反应。在较大剂量时他莫西芬可以下调大鼠乳腺ER和PR的表达[8]，这可以说明他莫西芬的组织特异性。

他莫西芬可以增加绝经期服用他莫西芬妇女患子宫内膜癌的风险，但随着他莫西芬用于乳腺癌高危人群的预防用药，绝经前妇女服用他莫西芬的安全问题也日益得到关注。本实验结果显示在大鼠中，他莫西芬对于有一定雌激素水平的子宫内膜有雌激素拮抗作用，可能对子宫内膜有一定保护作用。他莫西芬对乳腺癌细胞的作用不仅是其抗雌激素的作用，还有直接杀伤和诱导凋亡等其他作用，他莫西芬对乳腺癌细胞的作用是特异的。所以他莫西芬导致的子宫内膜病变可能是由于他莫西芬在低雌激素水平时表现的雌激素样作用。

他莫西芬在雌激素水平不同情况下作用不同的机制以及他莫西芬对受体水平调节的分子机制需要进一步研究，尤其是TAM给药对ER或PR下游信号的影响，为安全使用他莫西芬提供帮助。

参考文献：

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Effect of tamoxifen on serum estrogen and progesterone level as well as uterus estrogen and progesterone receptor expression in rats

ZHANG Mei1,YUAN Ben-li2，LV Yan-wen1

(1．DepartmentofGynaecologyandObstetrics,the463HospitalofPLA,Shenyang110042,China;2.InstituteofToxicDrugs,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China)

[Abstract]Objective To study the effects of tamoxifen on the levels of serum estrogen and progesterone as well as the expression of estrogen receptor (ERα, ERβ) and progesterone receptor (PR) in uterus in rats. Methods Forty female SD rats were randomly and evenly assigned into four groups: sham operated group (SHAM), sham operated plus tamoxifen (SHAM+TAM), bilaterally ovariectomized group (OVX), and bilaterally ovariectomized plus tamoxifen group (OVX+TAM). All animals were daily oral administrated with tamoxifen or solvent control for 28 days. Serum estrogen and progesterone levels were measured before and after tamoxifen administration. After the experiment, all the rats were sacrificed for uterus weighting, and uterus coefficient were calculated. The expression levels of ERα, ERβ, and PR in uterus were detected by Western blot assay. Results Tamoxifen significantly increased the serum estrogen levels in OVX rats, but decreased the serum estrogen levels in SHAM rats. In both OVX and SHAM rats, tamoxifen decreased the serum progesterone levels. Tamoxifen significantly decreased the uterus weight and uterus coefficient in SHAM rats, but increased the uterus weight and uterus coefficient in OVX rats. There was no significant effect of tamoxifen on ERα, while tamoxifen administration down-regulated the expression of ERβ and up-regulated the expression of PR. Conclusion Estrogen level could influence the effect of tomaxifen on sex hormone secretion. Tamoxifen could be associated with the pathogenesis of endometrium by tamoxifen changing hormone receptor expression.

[Key words]tamoxifen；uterus；estrogen receptor；progesterone receptor

作者简介：张 玫(1978-)，女，辽宁沈阳人，主治医师。E-mail：105325006@qq.com 通信作者：吕艳文，主任医师。E-mail：Lvyanwen1962@163.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.01.07

[中图分类号]R615

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)01-0028-04

(收稿日期2015-09-17；修回日期：2015-12-27)