慢性结石性胆囊炎胆汁胆固醇浓度与胆囊收缩素受体的特点及关系

朱任飞， 顾春燕，卢潮德，吴建军，吴金柱

(1. 南通市第三人民医院 肝胆外科，江苏 南通 226001；2. 南通市第三人民医院 病理科，江苏 南通 226001)



慢性结石性胆囊炎胆汁胆固醇浓度与胆囊收缩素受体的特点及关系

朱任飞1， 顾春燕2，卢潮德1，吴建军1，吴金柱1

(1. 南通市第三人民医院 肝胆外科，江苏 南通 226001；2. 南通市第三人民医院 病理科，江苏 南通 226001)

[摘要]目的通过检测慢性结石性胆囊炎患者胆囊胆汁胆固醇浓度(biliary cholesterol concentration，BCC)及胆囊黏膜上皮A型胆固醇受体(cholecystokinin-A receptor，CCK-AR)蛋白表达强度，明确BCC与CCK-AR的特点及关系。方法通过免疫组化的方法检测34例行腹腔镜手术的慢性结石性胆囊炎胆囊黏膜上皮CCK-AR蛋白表达强度，同时用生化方法检测胆囊内胆汁胆固醇浓度，观察结果特点并分析相关性。结果所有标本胆囊黏膜上皮CCK-AR呈阳性表达，其中13例呈弱阳性表达，9例呈中阳性表达，12例呈强阳性表达。胆囊内胆汁胆固醇浓度在CCK-AR弱阳性组，CCK-AR中阳性组，CCK-AR强阳性组分别为(14.44±5.51)mmol/L，(11.68±3.41)mmol/L和(6.96±1.19)mmol/L，与CCK-AR表达强度呈负相关(r=-0.702，P=0.000)。结论胆汁胆固醇浓度可作为评估胆囊黏膜上皮CCK-AR分子蛋白表达的潜在指标。

[关键词]胆汁胆固醇；胆囊收缩素受体；慢性结石性胆囊炎

[引用本文]朱任飞，顾春燕，卢潮德，等.慢性结石性胆囊炎胆汁胆固醇浓度与胆囊收缩素受体的特点及关系[J].大连医科大学学报，2016,38(2)：118-120,125.

慢性结石性胆囊炎已成为影响人类健康的常见病，目前对于胆囊结石的形成机制仍不清楚。人体内胆囊收缩素受体分为A及B，A型胆囊收缩素受体(cholecystokinin-A receptor,CCK-AR)广泛分布于胆囊黏膜细胞，通过与其配体胆囊收缩素结合，引起胆囊收缩。动物实验证实胆汁胆固醇浓度(biliary cholesterol concentration, BCC)升高可引起胆囊收缩素受体减少，从而导致胆囊收缩功能障碍。目前对于人体内胆汁胆固醇浓度与胆囊收缩素受体关系研究较少，本研究用免疫组化方法对胆囊CCK-AR表达进行观察及测定，并且用生化方法检测慢性结石性胆囊炎患者胆囊内胆汁胆固醇浓度，探讨CCK-AR与BCC的关系。

1材料和方法

1.1研究对象

选择2011年1月至2015年6月在南通市第三人民医院住院行腹腔镜手术治疗的胆囊标本34例，男11例，女23例，年龄(36.53±11.66)岁，胆囊单发结石22例，2枚结石8例，3枚结石4例，体重指数(BMI)(25.06±4.71)kg/m2。取胆囊内的胆汁及胆囊底部胆囊壁，经病理证实均为慢性结石性胆囊炎。

1.2方法

1.2.1BCC浓度测定

术中在胆囊底部，用20 mL空针加气腹针抽取胆囊中胆汁5～10 mL，将收集到的胆汁放置于15 mL离心管中，置于离心机中，吸取1 mL上清液，用蒸馏水稀释。将稀释后的胆汁置于4 ℃冰箱中储存，20 W日光灯下照射12 h，去除胆色素(主要为胆红素)。次日应用自动生化仪(AU2700)测定胆汁中总胆固醇浓度。试剂盒购自宁波美康生物技术有限公司。

1.2.2CCK-AR检测

所有胆囊壁标本均经10%中性福尔马林液固定，常规脱水，石蜡包埋，常规HE染色及免疫组化染色。免疫组化采用Envision二步法，操作参照试剂说明书进行，同时设PBS代替一抗的阴性对照。一抗Anti-CCK-AR抗体(CCKAR山羊多克隆抗体)及二抗Envision plus试剂盒均购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3结果判定

免疫组化染色结果采用半定量法进行判定，以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分，在切片的图像分析中，将细胞核和/或细胞质染成黄色的细胞定义为阳性细胞，细胞核和/或细胞质染成淡黄色为弱阳性细胞(+)；细胞核和/或细胞质染成深黄色为中阳性细胞(++)；细胞核和/或细胞质染成棕黄色或褐色为强阳性细胞(+++)。无着色为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色或褐色为3分。阳性细胞百分比为自左向右分别计数第1、3、5、7、9个视野(每400×高倍视野计数100个此类细胞)的阳性细胞平均数：0～5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比计分，染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0分为阴性 (-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。同时为计算BCC与胆囊收缩素CCK-AR表达关系，以5个视野内黏膜上皮CCK-AR蛋白表达阳性细胞总数来间接表示胆囊CCK-AR表达水平，在高倍(400倍)视野下，自标本的一侧自左向右分别计数第1、3、5、7、9个视野中阳性细胞的个数，将阳性细胞分别计数(每种细胞在每例标本中观察5个视野)。

1.4统计学方法

实验结果均采用SPSS for Windows 19.0软件进行统计，CCK-AR与BCC的关系采用Pearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1胆囊组织的HE染色结果

HE染色结果显示组织结构完整，细胞核、细胞质染色清晰。见图1。

图1　胆囊黏膜上皮(HE×100)Fig 1 Gallbladder mucosa (HE×100)

2.2胆囊黏膜上皮CCK-AR表达

免疫组化显示CCK-AR在黏膜上皮细胞中均有表达，半定量结果显示：13例呈弱阳性表达，9例呈中阳性表达，12例呈强阳性表达。见图2。

图2　胆囊黏膜上皮CCK-AR受体蛋白表达(×400)Fig 2 The CCK-AR expression in the gallbladder mucosa (×400)A：弱阳性表达；B：中阳性表达；C：强阳性表达

2.3胆汁胆固醇浓度与CCK-AR表达相关性

胆汁胆固醇浓度在弱阳性，中阳性，强阳性组分别为(14.44±5.51)mmol/L，(11.68±3.41)mmol/L和(6.96±1.19)mmol/L，与CCK-AR表达呈负相关(r=-0.702，P=0.000)。见图3。

图3　胆汁胆固醇浓度与胆囊CCK-AR表达相关性分析Fig 3 Correlation analysis between BCC and CCK-AR expression (n=34)

3讨论

慢性结石性胆囊炎是一种常见的消化系统疾病，在中国，胆囊结石的患病率大约为4.3%[1]，有学者提出了完全腹腔镜保胆取石术治疗慢性结石性胆囊炎[2]，对于此种手术争议的核心是胆囊结石的复发率问题，有文献报道胆囊结石5年复发率为6.6%[3]，以及伴随而来的二次手术的问题，这就需要探讨胆囊结石的成因。有学者发现，在喂食高胆固醇饮食的家兔中，胆汁中胆固醇含量升高，胆囊收缩功能减弱，胆囊结石发病率较正常对照组升高，提示胆汁中胆固醇含量的改变可能是影响胆囊收缩功能的直接因素[4]。Pozo等[5]实验研究表明，胆汁高浓度胆固醇可以渗透进入胆囊壁，改变膜上相关受体的活性，导致胆囊内胆汁的淤积，并最终形成胆囊结石。在体外实验中也观察到类似现象，胆囊标本收缩功能明显减弱，当去除过量的胆固醇后，其胆囊收缩功能有所恢复[6]，进一步验证了胆汁胆固醇浓度在胆囊收缩功能障碍产生过程中发挥着重要的作用，表明胆汁胆固醇浓度是胆囊收缩功能障碍的始动因素，胆汁胆固醇浓度会影响胆囊收缩功能。

胆囊收缩素受体分为A及B，A型胆囊收缩素受体(cholecystokinin-A receptor，CCK-AR)分布于胆囊黏膜，通过与其配体胆囊收缩素结合，引起胆囊收缩。同时，当CCK的信号传导系统发生障碍时，胆囊收缩功能下降，导致胆囊结石的形成。有学者通过实验证明敲除CCK-AR基因的小鼠其胆囊收缩功能减弱，胆囊结石发生率较野生型小鼠升高[7]，这表明胆汁胆固醇是通过胆囊收缩素受体，影响胆囊收缩功能。

本研究应用免疫组化方法观察了CCK-AR在胆囊黏膜上皮细胞中的表达情况，发现CCK-AR在胆囊黏膜上皮细胞中有明显的阳性表达，这与Rai等[8]之前的研究报道相一致，同时本研究分析了CCK-AR表达水平与胆汁胆固醇浓度关系，发现两者呈现明显相关性，即胆汁胆固醇浓度越高，胆囊黏膜上皮CCK-AR表达越低，既往有研究显示细胞膜上高胆固醇环境的存在使得CCK信号传导发生障碍，机体代偿增加CCK-AR的含量，维持胆囊收缩功能[9]，笔者考虑胆囊黏膜上皮CCK-AR与胆汁胆固醇浓度相关性可能跟年龄相关，这需要实验进一步证实。本研究提示胆汁胆固醇浓度可作为评估胆囊黏膜上皮CCK-AR分子蛋白表达的潜在指标，为进一步研究胆囊动力学提供了理论依据。

参考文献：

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[2] Gao DK, Wei SH, Li W, et al. Totally laparoscopic gallbladder-preserving surgery: Aminimally invasive and favorable approach for cholelithiasis[J]. Exp Ther Med,2015,9(2):395-398.

[3] 刘京山,李晋忠,赵期康,等.纤维胆道镜下胆囊切开取石保胆治疗胆囊结石612例随访结果分析[J].中华外科杂志,2009,47(2):279-282.

[4] 章琳,董蕾.高胆固醇饮食对胆囊结石形成和胆囊运动的影响[J].西安交通大学学报(医学版),2005,26(3):260-262.

[5] Pozo MJ,Camello PJ,Mawe GM. Chemical mediators of gallbladder dysmotility[J]. Cur Med Chem,2004,11(13):1801-1812.

[6] Xiao ZL,Schmitz F,Pricolo VE,et al. Role of caveolae in the pathogenesis of cholesterol-induced gallbladder muscle hypomotility[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292 (6): G1641-1649.

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[8] Rai R,Tewari M, Kumar M,et al. Expression profile of cholecystokinin type-A receptor in gallbladder cancer and gallstone disease [J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2011, 10(4):408-414.

[9] Karplus G,Ruiz R,Thomas DG,et al.Cholecystokinin receptor positivity in children with chronic acalculous gallbladder dysfimction: a pilot study to investigate the etiology of chronic acalculous gallbladder dysfunction[J]. J Pediatr Surg,2008,43(43):850-853.

Correlation of cholecystokinin receptor expression and biliary cholesterol concentration in chronic calculous cholecystitis

ZHU Ren-fei1, GU Chun-yan2, LU Chao-de1, WU Jian-jun1, WU Jin-zhu1

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,theThirdPeople'sHospitalofNantong,Nantong226001,China; 2.DepartmentofPathology,theThirdPeople'sHospitalofNantong,Nantong226001,China)

[Abstract]Objective To investigate the relationship of biliary cholesterol concentration and cholesterol cholecystokinin-A receptor expression in chronic calculous cholecystitis. Methods The biliary cholesterol concentration in the gallbladder of 34 cases were tested by biochemistry and cholesterol cholecystokinin-A receptor expression in the gallbladder mucosa of 34 cases were detected by immunohistochemistry. Results The cholesterol cholecystokinin-A receptor (CCK-AR) expression in the gallbladder mucosa of 34 cases showed positive expression, in which weak positive 13 cases, moderate positive 9 cases, and strong positive 12 cases. Bile cholesterol concentration in the weak positive group was (14.44±5.51) mmol/L，in the moderate positive group was (11.68±3.41) mmol/ L, and in the strong positive group was (6.96±1.19) mmol/L. The CCK-AR expression and biliary cholesterol concentration showed negative correlation (r=-0.702，P=0.000). Conclusion The bile cholesterol concentration may be used as potential indicators of CCK-AR expression in chronic calculous cholecystitis, providing a theoretical basis for further study of the gallbladder dynamics.

[Key words]biliary cholesterol; cholecystokinin receptor; chronic calculous cholecystitis

基金项目：南通市卫生局青年科研基金项目(WQ2014037)

作者简介：朱任飞(1986-)，男，江苏南通人，主治医师。E-mail:4392357@qq.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.02.04

[中图分类号]R602

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)02-0118-03

(收稿日期：2015-12-06；修回日期：2016-03-13)