MCT1在鼻咽癌病人外周血MDSC中的表达及意义

张　娜，蓝瑞隆，钟光贤

(1. 福建医科大学附属协和医院 血液科，福建省血液病研究所，福建省血液病学重点实验室， 福建 福州 350001；2.福建医科大学附属第一医院 中心实验室，福建 福州 350005；3.福建医科大学附属第一医院 骨科，福建 福州 350005)



MCT1在鼻咽癌病人外周血MDSC中的表达及意义

张娜1，蓝瑞隆2，钟光贤3

(1. 福建医科大学附属协和医院 血液科，福建省血液病研究所，福建省血液病学重点实验室， 福建 福州 350001；2.福建医科大学附属第一医院 中心实验室，福建 福州 350005；3.福建医科大学附属第一医院 骨科，福建 福州 350005)

[摘要]目的检测单羧酸转运体1(MCT1)在鼻咽癌病人和正常人外周血髓系抑制性细胞(MDSC)中的表达并探讨其临床意义。方法随机收集经病理确诊的鼻咽癌病人和正常人外周血各10例，红细胞裂解液处理后，采用BD FACSAria Ⅲ流式细胞仪分选出MDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-)，q-PCR检测比较两组MCT1 mRNA水平的差异。结果鼻咽癌病人外周血中MDSC的比例(19.77±4.77)%显著高于正常人(0.84±0.18)%，P<0.001；且前者MCT1 mRNA水平(4.05±0.56)为后者(2.15±0.33)的1.88倍，差异有显著性意义(P<0.01)。结论鼻咽癌病人外周血中的MDSC可能是凭借其在数量上的优势及能量代谢上的特性，更好地发挥免疫抑制效应。

[关键词]MCT1; MDSC; 鼻咽癌；能量代谢；免疫抑制

[引用本文]张娜，蓝瑞隆，钟光贤.MCT1在鼻咽癌病人外周血MDSC中的表达及意义[J].大连医科大学学报，2016,38(2)：114-117.

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) 是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，有较强的人种和地域分布特点，多发于东亚和非洲，中国的南部地区，包括广东、福建、湖南等省为高发区[1-3]。放射治疗是鼻咽癌治疗的首选治疗方法[4]，也常辅化学药物治疗，其5年生存率为80%左右。导致生存率无法继续提升的原因除了部分患者出现放化疗抵抗外，免疫抑制性细胞如MDSC、Treg等介导的肿瘤免疫逃逸也是不容忽视的重要原因。

髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是由骨髓中共同髓系祖细胞(CMP)分化发育而来，缺乏成熟粒细胞、Mφ或树突状细胞的特殊细胞表面标志，却具有粒细胞或单核细胞的形态[5-7]，在人类，MDSC最常见的细胞表型为CD14-CD11b+，或表达髓系共同标志CD33，但不表达MHC-Ⅱ类分子HLA-DR及成熟的髓系或淋巴系标记。该群细胞在许多肿瘤(如乳腺癌、胶质瘤、非小细胞肺癌等)微环境中大量扩增，可以通过表达高水平精氨酸酶1(arginase-1，ARG1)[8]、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)[9]和细胞-细胞间接触[10]等多种作用方式有效抑制机体免疫应答。既能够抑制NK细胞和NKT细胞介导的天然免疫反应，又能够抑制CD4+和CD8+T细胞介导的适应性免疫反应。

细胞功能的发挥伴随着不同的能量代谢水平，能量代谢水平的变化直接影响细胞的生命状态(如正常分裂、分化或者恶性增殖等)，对细胞的生存和稳态的维持起着核心作用[11]。单羧酸转运体1(monocarboxylate transporter 1，MCT1) 是能量代谢中的重要分子，它是一种细胞跨膜蛋白，可将乳酸从胞外摄入到胞内从而降低机体的乳酸水平。MDSC在许多肿瘤微环境中大量存在，其能量代谢相关基因的表达水平也必定在其功能维持中起着重要作用。目前，MDSC在鼻咽癌病人中的相关研究及MCT1是否对MDCS的功能发挥某种作用鲜见报道。本研究通过检测正常人和鼻咽癌病人外周血中MDSC的含量，并检测能量代谢重要分子MCT1的mRNA水平，初步探讨MCT1对MDSC免疫抑制功能发挥的作用。

1材料和方法

1.1主要试剂

RNA提取试剂盒(Promega)；real-time PCR检测试剂盒(Promega)；红细胞裂解液(碧云天)；FITC-anti-human CD11b抗体(Cat. # 301330)、PE-anti-human CD33抗体(Cat. # 366608)、APC-anti-human HLA-DR抗体(Cat. # 361610)均购自Biolegend。

1.2方法

随机收集福建医科大学附属第一医院放疗科2014年9月至11月间10例鼻咽癌病人(中位年龄为41.5岁，经MRI规范扫描并行病理确诊，采血前均未接受放化疗)的外周血作为实验组(NPC组)；随机收集福建医科大学附属第一医院体检中心2014年11月的10例正常人(中位年龄为39.7岁，近5年无重大疾病且近1个月无感冒发烧等身体不适)的外周血为作对照组。男女比例均为1∶1。

红细胞裂解：加入3～5倍细胞体积的1×红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1～2 min后400～500 g离心5 min，弃上清。

MDSC分选：按照说明书用PBS或者生理盐水稀释FITC-anti-human CD11b、PE-anti-human CD33以及APC-anti-human HLA-DR抗体，室温标记40 min后生理盐水重悬，离心弃上清后按约1.0×107/mL细胞密度加入一定体积的生理盐水重悬细胞，分选出MDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-)细胞亚群。

q-PCR检测MCT1 mRNA水平：按照试剂盒说明书提取MDSC总RNA，q-PCR检测鼻咽癌病人和正常人MDSC中MCT1的mRNA水平差异。MCT1(扩增长度为132 bp)引物序列为：sense-5′-GTGGCTCAGCTCCGTATTGT-3′；antisense-5′- GAGCCGACCTAAAAGTGGTG-3′；相时扩增内参GAPDH，引物序列为：sense-5′- ATGACAT-CAAGAAGGTGGTG-3′，antisense-5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′。扩增条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40个循环，同时采用2-ΔΔCt法计算各样本的MCT1 mRNA相对表达量。

1.3统计学方法

采用GraphPad Prism 5 软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验，P<0.05 认为差异有统计学意义。

2结果

2.1流式分选结果

鼻咽癌病人和正常人外周血MDSC(CD11b+CD33+HLA-DR-)分选情况见图1。鼻咽癌病人外周血中MDSC的比例为(19.77±4.77)%，是正常人(0.84±0.18)%的23.55倍，差异有显著性意义，P<0.001。见图2。

2.2鼻咽癌病人和正常人外周血MDSC中MCT1 mRNA水平比较

用管家基因GAPDH进行标准化，q-PCR结果表明：鼻咽癌病人外周血MDSC中MCT1 mRNA水平(4.05±0.56)为正常人(2.15±0.33)的1.88倍，两组间差异有显著性意义，P<0.01。见图3。

图1　流式分选人外周血MDSC(CD11b+CD33+ HLA-DR- )Fig 1 PBMC MDSC(CD11b+CD33+ HLA-DR- ) sorted by FACS

图2　正常人和鼻咽癌病人MDSC占外周血单个核细胞的比例Fig 2 MDSC ratio in PBMC of healthy donors and NPC patients*与正常人比较，P<0.001

图3　q-PCR检测人外周血MDSC中MCT mRNA的相对表达量Fig 3 MCT mRNA level of MDSC by q-PCR*与正常人比较，P<0.01

3讨论

免疫抑制性细胞MDSC能够下调抗肿瘤免疫反应。已有许多研究表明，MDSC的清除能够显著提高抗肿瘤免疫反应。MDSC在肿瘤分泌相关因子包括IL-6、GM-CSF、IL-1β的招募下，从骨髓进入外周血并最终聚集于肿瘤的原发灶和转移灶，通过表达arginase I、iNOS以及产生免疫抑制因子如ROS、IL-6、 IL-10、TGFβ1进而发挥免疫抑制效应。大量研究已经证实，MDSC在许多肿瘤病人外周血和肿瘤微环境中大量存在，并且与肿瘤预后不良有关。本研究流式分选结果表明，鼻咽癌病人外周血中的MDSC比例显著高于正常人，这与其他许多肿瘤中的报道一致。而大量的MDSC为免疫抑制功能的发挥提供了重要条件。

在能量代谢旺盛的肿瘤微环境中，肿瘤细胞本身的迅速增殖消耗了大量的能源物质(如葡萄糖)，故可供MDSC利用的能源物质比较有限，这对大量浸润于肿瘤微环境中的MDSC是极为不利的。肿瘤细胞通过无氧糖酵解快速获取能量以满足自身迅速增殖的需要，但也将大量地排出能量代谢中间产物乳酸，使得肿瘤局部微环境大量乳酸堆积，不利于肿瘤的发生发展。已有研究表明，氧气充足区的肿瘤细胞和内皮细胞能够通过MCT1利用肿瘤细胞糖酵解代谢所产生的乳酸[11]。而在肿瘤微环境中大量存在的MDSC是否也能够利用其中的代谢中间产物乳酸则鲜见报道。本研究结果表明，MCT1 mRNA在鼻咽癌病人MDSC中的表达显著高于正常人，而高表达的MCT1分子无疑为MDSC打开了一个重要的能量分子通道，能够将肿瘤微环境中的乳酸转运至细胞内，满足MDSC的耗能需求。肿瘤微环境中乳酸浓度的降低为肿瘤的存活和转移提供了有利条件。可以推测，MDSC正是以这种“能量寄生”的方式，在缓解肿瘤微环境乳酸堆积的同时也为获得了大量的能源物质，这为其自身免疫抑制功能的发挥提供了重要条件。

综上，鼻咽癌病人外周血中的MDSC不但在数量上显著高于正常人，而且其能量代谢的重要分子MCT1也显著高于正常人，后者为其在能源物质相对匮乏的肿瘤微环境中以乳酸为能量来源提供了前提，这将为以MCT1为靶点阻碍MDSC的免疫抑制功能发挥提供了实验依据。也许鼻咽癌病人中的MDSC正是凭借其在数量及能量代谢上的特殊优势，更好地发挥了其免疫抑制效应，而这其中的机制尚需进一步深入研究。

参考文献:

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Expression and significance of MCT1 in MDSC from peripheral blood of nasopharyngeal carcinoma patients

ZHANG Na1, LAN Rui-long2, ZHONG Guang-xian3

(1.DepartmentofHematology,FujianMedicalUniversityUnionHospital，FujianInsituteofHematology，FujianProvincialKeyLaboratoryofHematology,Fuzhou350001,China; 2.DepartmentofCentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China； 3.DepartmentofOrthopaedics,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China)

[Abstract]Objective To investigate MCT1 expression of MDSC in peripheral blood obtained from nasopharyngeal carcinoma (NPC) patients and healthy donors, and discuss its clinical significance. Methods Peripheral blood samples were obtained randomly from 10 NPC patients and 10 healthy donors, processed by RBC lysates and MDSC (CD11b+CD33+HLA-DR-) within them were sorted by BD FACSAriaⅢ. qRT-PCR were adopt to determine the MCT1 mRNA levels, t-test was used to evaluate the significance between groups. Results The MDSC ratio of NPC patients (19.77±4.77)% was significant higher than that of healthy donors (0.84±0.18)% (P<0.001). MCT1 mRNA level (4.05±0.56) of MDSC obtained from NPC patients was significantly higher than that of healthy donors (2.15±0.33) (P<0.01). Conclusion MDSC within peripheral blood of NPC patients could play an immunosuppressive effect by its superiority in number and energy metabolism property.

[Key words]MCT1; MDSC; nasopharyngeal carcinoma; energy metabolism; immunosuppression

基金项目:福建省自然科学基金项目(2014J05088)

作者简介:张 娜(1986-)，女，吉林松原人，检验技师。E-mail：zhanglin770@126.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.02.03

[中图分类号]R739.62; R739.63

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)02-0114-04

(收稿日期:2015-12-11；修回日期：2016-03-18)