microRNA-451在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血浆中的表达及意义

张　平

(天津市第五中心医院血液肿瘤内科，天津　300450)



◇经验交流◇

microRNA-451在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血浆中的表达及意义

张平

(天津市第五中心医院血液肿瘤内科，天津300450)

摘要：目的探讨microRNA-451(miR-451)在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B lymphoma, DLBCL)患者血浆中的表达水平及其临床意义。方法利用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测27例DLBCL患者和27例健康体检者血浆中miR-451的表达水平，并统计分析DLBCL患者血浆中miR-451表达水平与临床病理参数之间的关系。结果miR-451在DLBCL患者血浆中表达水平明显低于正常对照组[(0.41±0.15)vs.(0.64±0.21)]，二者差异具有统计学意义(P<0.01)；DLBCL患者血浆中miR-451表达水平在不同性别、年龄、血清LDH水平及原发部位之间差异无统计学意义(P>0.05)，而与Ann Arbor分期及IPI评分明显相关(P<0.05)。结论DLBCL患者血浆中miR-451表达水平降低，可能参与了DLBCL的病理过程。

关键词：弥漫性大B细胞淋巴瘤；microRNA-451；定量PCR

淋巴瘤(lymphoma)是免疫系统的恶性肿瘤，起源于淋巴结和淋巴组织，其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的某种免疫细胞恶变有关。按组织病理学改变，淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)两大类。弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一种类型，约占35%～40%。淋巴瘤是最早发现的血液系统恶性肿瘤之一。我国淋巴瘤的总发病率男性为1.39/10万，女性为0.84/10万，死亡率为1.5/10万。一般认为感染及免疫因素起重要作用，理化因素及遗传因素等也有不可忽视的作用，病毒学说颇受重视。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一类长度约为18～25 nt保守的单链非编码RNA，主要通过与靶基因mRNA的3′端非编码区域(3′-untranslated region, 3′-UTR)结合进而抑制该基因的表达，从而在转录后水平发挥基因调节作用。目前普遍认为miRNA与肿瘤的发生发展密切相关[2]，多项研究发现多种miRNA在淋巴瘤的发病过程中发挥一定作用[3-6]。miR-451是新近发现的一种miRNA，研究表明miR-451在多种实体瘤及血液系统肿瘤中表达异常[7-13]，有学者研究发现miR-451在间变性大细胞淋巴瘤[14]、滤泡性淋巴瘤[15]中表达异常。目前，miR-451在DLBCL中的研究甚少，为了进一步研究miR-451在DLBCL发病中的作用，我们利用定量PCR方法检测了DLBCL患者血浆中miR-451的表达水平，并分析其与临床病理参数之间的关系。

1材料与方法

1.1研究对象选取2014年1月至2015年9月在我院血液内科住院治疗的诊断标准符合中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南(2013年版)[16]的DLBCL患者27例，其中男性17例，女性10例，年龄21～73岁，中位年龄61岁，所有病例均经过术后病理证实为DLBCL。排除标准：原发或继发中枢神经系统、纵隔大B细胞淋巴瘤和血管内大B细胞淋巴瘤、合并其他肿瘤性疾病、严重的感染、合并自身免疫性疾病等。选择同期27例健康体检者作为正常对照组，其中男性16例，女性11例，年龄18～70岁，中位年龄59岁，两组研究对象之间性别、年龄的差异无统计学意义(P>0.05)，本项研究得到医院伦理委员会同意并取得研究对象的知情同意。

1.2方法

1.2.1样本采集无菌采集所有研究对象的静脉血5.0 mL，置入EDTA抗凝管中，所有DLBCL患者在抗肿瘤治疗前进行采集血样，分别室温下2 500 r/min离心10 min、4 ℃ 12 000 r/min离心10 min后收集上清至无RNA酶的EP管中，-80 ℃保存。

1.2.2定量PCR检测血浆中miR-451表达水平血浆中总RNA提取采用mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(美国Ambion公司)，严格按照试剂盒说明进行操作。提取的RNA溶于20 μL EDPC处理的水中，利用紫外分光光度仪(美国基因有限公司)检测A260、A280值，计算RNA浓度和纯度，A260/A280比值在1.8～2.1的RNA样本用于后续实验。根据文献[17]合成miR-451逆转录引物及PCR引物。miR-451逆转录引物序列：TCAACTGGTGTCGT-GGAGTCGGCAATTCAGTTGAAACTCAGT，PCR上

游引物序列：AAACCGTTACCATTACTGAG，下游引物序列：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG。使用miScript Reverse Transcription试剂盒(美国Ambion公司)进行逆转录反应合成cDNA第一链，合成的cDNA -20 ℃保存。利用SYBR®Premix ExTaqTMⅡ(德国Qiagen公司)进行定量PCR扩增(美国Bio-Rad公司)，PCR反应体系为：SYBR®Premix ExTaqTMⅡ10 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、3.0 μL模板和5.0 μL双蒸水。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 5 s、61 ℃ 40 s共35个循环，每个样本做三个复孔，PCR扩增结束后得到循环阈值(Ct值)，miR-451的表达水平采用2-△△Ct进行分析。

2结果

2.1DLBCL患者与正常对照组血浆中miR-451表达水平的比较定量PCR检测结果发现miR-451在DLBCL患者血浆中表达水平明显低于正常对照组[(0.41±0.15)vs.(0.64±0.21)]，二者差异具有统计学意义(t=4.631，P<0.01)。

2.2miR-451表达水平与DLBCL临床病理参数的关系为了进一步探讨miR-451与DLBCL之间的关系，我们统计分析了miR-451表达水平与DLBCL临床病理参数的关系，结果显示DLBCL患者血浆中miR-451表达水平在不同性别、年龄、血清LDH水平及原发部位之间差异无统计学意义(P>0.05)，而Ⅲ/Ⅳ期DLBCL患者血浆中miR-451水平明显低于Ⅰ/Ⅱ期患者，二者差异具有统计学意义(P<0.05)，IPI评分3～5分的DLBCL患者血浆中miR-451水平明显低于0～2分的患者，二者差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

3讨论

非霍奇金淋巴瘤是一组具有不同的组织学特点和起病部位的淋巴瘤，易发生早期远处扩散。DLBCL是非霍奇金淋巴瘤的一种，主要分为非特指型、可确定的亚型和其他B细胞型三大类。多数为原发DLBCL，也可以由惰性淋巴瘤进展或转化而来，经过以蒽环类药物为基础的化疗，有超过70%的DLBCL获得缓解，但最终只有50%～60%的患者获得长期无病生存[18]。近年来应用新的药物，如抗CD20单克隆抗体，或对预后不良的患者给予强化疗，明显改善了这类患者的预后。miRNA通过在转录后水平调控靶基因的表达，参与了细胞增殖、凋亡和分化过程，目前大量研究表明多种miRNA在实体肿瘤中表达异常可以作为原癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发病过程[2]，随着研究不断深入，miRNA在血液系统肿瘤中的作用越来越受到重视，多项研究发现多种miRNA在淋巴瘤的表达异常，参与了淋巴瘤的发病过程[3-6]。国内外学者研究发现miR-34、miR-125a、miR-125b及miR-155等与DLBCL的发病过程有关，而外周血中miR-21、miR-155、miR-210、miR-221等表达水平与DLBCL的诊断、治疗及预后密切相关[19-24]。

表1DLBCL患者血浆中miR-451水平与临床病理参数的关系

Tab.1Relationship between the plasma level of miR-451 and clinicopathological characteristics in the patients with DLBCL

参数例数miR-451(x±s)t值P值性别0.5020.619 女100.39±0.13 男170.42±0.16年龄0.9490.351 ≥60岁80.37±0.12 <60岁190.43±0.16血清LDH1.5430.135 正常160.45±0.17 升高110.36±0.11原发部位0.8680.393 淋巴结内180.43±0.15 淋巴结外90.38±0.12AnnArbor分期2.9790.006 Ⅰ+Ⅱ150.49±0.18 Ⅲ+Ⅳ120.32±0.09IPI评分3.7140.001 0～2分130.52±0.19 3～5分140.31±0.09

miR-451是2005年由ALTUVIA等在人脑垂体RNA中发现的一种miRNA，定位于人染色体19q11.2，研究表明miR-451在胃癌、膀胱癌、鼻咽癌等实体瘤组织中表达降低[7-12]。LOPOTOVA等[13]研究也发现miR-451在慢性髓细胞白血病患者体内低表达，miR-451与BCR-ABL的表达相互抑制，参与了慢性髓细胞白血病的发病。国内学者研究发现儿童急性前B淋巴细胞白血病中miR-451的表达水平明显低于正常对照组，提示miR-451在急性前B淋巴细胞白血病中可能发挥了一定作用[25]。研究证实miRNA由于长度较短且具有较强的抵抗RNA酶的降解，可以在血液中稳定存在[26]。有研究显示DLBCL患者血清中miR-15a，miR-16-1，miR-29c和miR-155水平比正常人明显升高，而血清中miR-34a水平降低，提示血清中miRNA可作为DLBCL潜在的诊断指标[27]。LIU等[14]研究发现在间变性大细胞淋巴瘤组织中miR-451表达降低，国外学者利用实时定量PCR方法发现在滤泡性淋巴瘤患者骨髓中miR-451水平降低[15]。目前，有关miR-451与DLBCL的研究甚少，为了进一步研究miR-451在DLBCL发病中的作用，本研究利用定量PCR检测了DLBCL患者血浆中miR-451的表达水平，结果发现miR-451在DLBCL患者血浆中表达水平明显低于正常对照组，二者差异具有统计学意义(P<0.01)。这与miR-451在间变性大细胞淋巴瘤[14]、滤泡性淋巴瘤[15]中的研究结果基本一致，提示miR-451参与了DLBCL的发病过程。同时，本研究还统计分析了miR-451与DLBCL临床病理参数之间的关系，结果显示在不同性别、年龄、血清LDH水平及原发部位之间差异无统计学意义(P>0.05)，而与Ann Arbor分期及IPI评分明显相关(P<0.05)，提示miR-451可能有助于DLBCL的分期及判断预后。

综上所述，DLBCL患者血浆中miR-451表达水平降低，与Ann Arbor分期及IPI评分相关，提示miR-451参与了DLBCL的发生发展过程，有可能成为肿瘤分期及预后判断的潜在指标。但是，miR-451在DLBCL中的具体作用机制尚不清楚。随着对miR-451与DLBCL研究的不断深入，可能为DLBCL的早期诊断、预后及治疗提供新的靶点。

参考文献：

[1] LAFARO KJ, DEMIRJIAN AN, PAWLIK TM. Epidemiology of hepatocellular carcinoma[J]. Surg Oncol Clin N Am, 2015, 24(1):1-17.

[2] JANSSON MD, LUND AH. MicroRNA and cancer[J]. Mol Oncol, 2012, 6(6):590-610.

[3] ZHENG RL, JIANG YJ, WANG X. Role of microRNAs on therapy resistance in non-Hodgkin’s lymphoma[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(11):3818-3832.

[4] PAN Y, MENG M, ZHANG G, et al. Oncogenic microRNAs in the genesis of leukemia and lymphoma[J]. Curr Pharm Des, 2014, 20(33):5260-5267.

[5] JARDIN F, FIGEAC M. MicroRNAs in lymphoma, from diagnosis to targeted therapy[J]. Curr Opin Oncol, 2013, 25(5):480-486.

[6] TAGAWA H, IKEDA S, SAWADA K. Role of microRNA in the pathogenesis of malignant lymphoma[J]. Cancer Sci, 2013, 104(7):801-809.

[7] PAN X, WANG R, WANG ZX. The potential role of miR-451 in cancer diagnosis, prognosis, and therapy[J]. Mol Cancer Ther, 2013, 12(7):1153-1162.

[8] SU Z, ZHAO J, RONG Z, et al. MiR-451, a potential prognostic biomarker and tumor suppressor for gastric cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(8):9154-9160.

[9] ZENG T, PENG L, CHAO C, et al. miR-451 inhibits invasion and proliferation of bladder cancer by regulating EMT[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(11):7653-7662.

[10] ZHANG F, HUANG W, SHENG M, et al. MiR-451 inhibits cell growth and invasion by targeting CXCL16 and is associated with prognosis of osteosarcoma patients[J]. Tumour Biol, 2015, 6(3):2041-2048.

[11] ZHANG T, SUN Q, LIU T, et al. MiR-451 increases radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells by targeting ras-related protein 14 (RAB14)[J]. Tumour Biol, 2014, 35(12):12593-12599.

[12] BANDDRES E, BITARTE N, ARIAS F, et al. MicroRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(7):2281-2290.

[13] LOPOTOVA T, ZACKOVA M, KLAMOVA H, et al. MicroRNA-451 in chronic myeloid leukemia: miR-451-BCR-ABL regulatory loop?[J]. Leuk Res, 2011, 35(7): 974-977.

[14] LIU C, IQBAL J, TERUYA-FELDSTEIN J, et al. MicroRNA expression profiling identifies molecular signatures associated with anaplastic large cell lymphoma[J]. Blood, 2013, 122(12):2083-2092.

[15] TAKE Y, OHNISHI N, KISAKA M, et al. Determination of abnormally expressed microRNAs in bone marrow smears from patients with follicular lymphomas[J]. Springerplus, 2014, 3:288.

[16] 中华医学会血液学分会、中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会. 中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南(2013年版)[J]. 中华血液学杂志, 2013, 34(9):816-819.

[17] 谢海涛. 结肠癌组织中miR-451表达的检测与分析[J]. 中南医学科学杂志, 2012, 40(3):257-259.

[18] CHAN WJ. Pathogenesis of diffuse large B cell lymphoma[J]. Int J Hematol, 2010, 92(2):219-230.

[19] MAZAN-MAMCZARZ K, GARTENHAUS RB. Role of microRNA deregulation in the pathogenesis of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)[J]. Leuk Res, 2013, 37(11):1420-1428

[20] TROPPAN K, WENZL K, DEUTSCH A, et al. MicroRNAs in diffuse large B-cell lymphoma: implications for pathogenesis, diagnosis, prognosis and therapy[J]. Anticancer Res, 2014, 34(2):557-564.

[21] J∅RGENSEN LK, POULSEN MØ, LAURSEN MB, et al. MicroRNAs as novel biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma—a systematic review[J]. Dan Med J, 2015, 62(5):A5048.

[22] SHEPSHELOVICH D, RAM R, UZIEL O, et al. MicroRNA signature is indicative of long term prognosis in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Leuk Res, 2015, 39(6):632-637.

[23] SONG G, GU L, LI J, et al. Serum microRNA expression profiling predict response to R-CHOP treatment in diffuse large B cell lymphoma patients[J]. Ann Hematol, 2014, 93(10):1735-1743.

[24] CHEN W, WANG H, CHEN H, et al. Clinical significance and detection of microRNA-21 in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma in Chinese population[J]. Eur J Haematol, 2014, 92(5):407-412.

[25] JU X, LI D, SHI Q, et al. Differential microRNA expression in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[J]. Pediatr Hematol Oncol, 2009, 26(1):1-10.

[26] ZEN K, ZHANG CY. Circulating microRNAs: a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers[J]. Med Res Rev, 2012, 32(2):326-348.

[27] FANG C, ZHU DX, DONG HJ, et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers for diffuse large B cell lymphoma[J]. Ann Hematol, 2012, 91(4):553-559.

(编辑韩维栋)

收稿日期：2015-12-02修回日期：2015-12-28

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81471175)

通讯作者：张平. E-mail: zphcgd@163.com

中图分类号：R733.4

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604029

Expression levels and clinical significance of microRNA-451 in the plasma of patients with diffuse large B lymphoma

ZHANG Ping

(Department of Internal Medicine, Hematology and Oncology of Tianjin Fifth Central Hospital, Tianjin 300450, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression level and clinical significance of microRNA-451 (miR-451) in the plasma of patients with diffuse large B lymphoma (DLBCL). MethodsWe enrolled 27 patients with DLBCL and 27 healthy controls for the study. The plasma level of miR-451 was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Then we analyzed the relationship between the plasma level of miR-451 and pathological characteristics of DLBCL. ResultsThe plasma level of miR-451 in the patients with DLBCL was significantly lower than in healthy controls [(0.41±0.15) vs. (0.64±0.21)] (P<0.01). However, the plasma level of miR-451 was not significantly correlated with the patients’ gender, age, serum LDH level or primary site (P>0.05), but with Ann Arbor tumor stage and IPI score (P<0.05). ConclusionThe plasma level of miR-451 decreases in patients with DLBCL, which indicates that miR-451 may participate in the pathology of DLBCL.

KEY WORDS:diffuse large B lymphoma; microRNA-451; RT-PCR

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81471175)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160608.1633.016.html(2016-06-08)