盐酸小檗碱调节大鼠实验性牙周炎牙龈组织MMPs/TIMP表达变化及其机制

孙俊毅，朱春晖，刘　瑾，李　昂，董　妍，李冬玲

(1. 西安交通大学口腔医院牙周科，陕西西安　710004；2. 西安交通大学第二附属医院中国皮肤性病学杂志编辑部，陕西西安　710004；3. 西安交通大学医学部药理学系，陕西西安　710061)



◇基础研究◇

盐酸小檗碱调节大鼠实验性牙周炎牙龈组织MMPs/TIMP表达变化及其机制

孙俊毅1，朱春晖1，刘瑾1，李昂1，董妍2，李冬玲3

(1. 西安交通大学口腔医院牙周科，陕西西安710004；2. 西安交通大学第二附属医院中国皮肤性病学杂志编辑部，陕西西安710004；3. 西安交通大学医学部药理学系，陕西西安710061)

摘要：目的探讨盐酸小檗碱对牙周炎基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制物(MMPs/TIMP)的调控及其机制。方法采用丝线结扎+菌液注射法建立大鼠牙周炎模型后，给予150 mg/(kg·d)盐酸小檗碱或生理盐水干预。显微X射线断层计算机扫描(μ-CT)和苏木素-伊红(HE)染色观察牙周组织学改变，Western blot检测大鼠牙龈组织MMP-2、MMP-9、TIMP-2的蛋白表达及P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平，ELISA测定牙龈组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的含量。结果牙周检查发现牙周炎组大鼠牙龈红肿明显，触之易出血，牙周袋较深，μ-CT显示牙槽骨吸收明显，牙龈组织TNF-α和IL-1β含量显著增加，MMP-2和MMP-9表达增多，并伴有磷酸化P38 MAPK/NF-κB上调。盐酸小檗碱治疗后可明显改善牙周情况，减少牙槽骨吸收，降低牙龈组织TNF-α和IL-1β含量，抑制P38 MAPK/NF-κB磷酸化，最终降低MMP-2和MMP-9的过度表达并提高TIMP-2的表达。结论盐酸小檗碱可能通过抑制P38 MAPK/NF-κB磷酸化，降低牙龈组织TNF-α和IL-1β，调节牙龈组织MMPs/TIMP的过量表达而发挥对大鼠牙周炎的治疗作用。

关键词：牙周炎；盐酸小檗碱；炎症；基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制物(MMPs/TIMP)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；白介素-1β(IL-1β); P38 MAPK/NF-κB

牙周炎主要是由细菌感染引起的牙周组织慢性炎性疾病，会造成进行性牙周附着丧失和牙槽骨吸收，形成牙周袋，最终可导致牙齿脱落，是成人失牙的主要原因[1]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类参与细胞外基质降解的蛋白酶。牙菌斑和感染引起的牙周炎症反应可诱导MMPs大量表达，使其活性增强，从而介导牙周组织的瓦解[2]。

临床研究发现，慢性牙周炎患者龈沟液中活化的MMP-9含量明显增加，经有效治疗后，可使升高的MMP-9降低[3]。牙周炎患者不仅牙龈组织中MMP-2和MMP-9表达增加，龈沟液中MMP-2表达也增多[4]，牙周袋邻近的非牙龈组织中MMP-2 mRNA表达也增多[5]。基础研究发现，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)可直接刺激人牙周膜成纤维细胞高表达MMP-2[6]；MMP-2和MMP-9在牙周炎症中大量表达；尤其是炎症慢性期(30～90 d)MMP-2、MMP-9在牙周的成纤维细胞、巨噬细胞、浸润的中性粒细胞和淋巴细胞中大量表达。这表明MMP-2、MMP-9不仅在牙周炎症的发生过程起到重要作用，也促进了牙周组织损毁过程中细胞外基质的降解[7]。临床上用于控制牙周炎炎症的药物较少。研究发现黄连的主要有效成分之一盐酸小檗碱具有抑菌抗炎作用[8-9]，可促进大鼠实验性牙周炎模型牙周组织的修复并抑制炎性细胞因子的表达[10]，还可以降低MMPs的表达[11]。但对MMP-2和MMP-9表达的调节机制和信号通路尚不清楚。本研究拟建立大鼠牙周炎模型，应用盐酸小檗碱治疗并观察牙槽骨吸收程度和牙周组织学改变，检测MMP-2、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制物-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2, TIMP-2)的蛋白表达、细胞因子TNF-α、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)水平以及促炎信号通路P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平，探讨盐酸小檗碱调节MMP-2、MMP-9和TIMP-2的可能机制及参与调节的信号分子。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(220～250 g)由西安交通大学医学部实验动物中心提供。该实验伦理经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准。牙龈卟啉单胞菌菌液由四川大学华西口腔医学院重点实验室微生物室提供；盐酸小檗碱(西安飞达生物技术有限公司)；组织蛋白提取试剂RIPA、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，中国江苏)；小鼠抗大鼠MMP-2抗体、小鼠抗大鼠MMP-9抗体、兔抗大鼠TIMP-2抗体、兔抗大鼠P38 MAPK抗体、兔抗大鼠磷酸化P38 MAPK抗体(Tyr182)(Santa Cruz，美国)；兔抗大鼠NF-κB抗体、兔抗大鼠磷酸化NF-κB抗体(Ser536)(Cell Signaling Technology, 美国)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗兔二抗、HRP标记的羊抗小鼠二抗(博士德，中国武汉)；PVDF膜、化学发光液(Millipore，美国)；大鼠TNF-α酶联免疫试剂盒、大鼠IL-1β酶联免疫试剂盒(R&D，美国)。

1.2大鼠牙周炎模型的建立健康清洁型雄性SD大鼠共35只，体质量(220±10)g，动物进行编号并随机抽取分为假手术组(sham group，n=10)和模型组(25只)。牙周炎模型建立方法如下(8周)：100 g/L水合氯醛(0.3 mL/100 g，ip.)麻醉大鼠，1号非吸收外科缝合丝线结扎于大鼠双侧上颌第一磨牙颈部，并于龈沟底注射牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis)菌液20 μL，于结扎后的第3、5、7天分别注射菌液1次，结扎后8周去除结扎线，随机分为2组灌胃：①牙周炎组(periodontitis group)：等体积生理盐水灌胃；②盐酸小檗碱组(periodontitis+berberine)：[150 mg/(kg·d)]盐酸小檗碱灌胃4周；假手术组大鼠上颌第一磨牙穿线不结扎并注射菌液等体积(20 μL)的灭菌生理盐水。实验结束后处死大鼠并收集上颌第一磨牙周围牙龈组织，―80 ℃保存，40 g/L多聚甲醛固定上颌备后续实验使用。

1.3显微X射线计算机断层扫描40 g/L多聚甲醛固定大鼠上颌磨牙及牙槽骨48 h后，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，德国YXLON微米X射线三维成像系统行显微X射线计算机断层扫描(micro X-ray computed tomography, μ-CT)，并重建上颌磨牙及牙槽骨三维结构，观察大鼠牙槽骨吸收情况。

1.4苏木素-伊红(HE)染色40 g/L多聚甲醛固定大鼠上颌48 h，100 g/L EDTANa脱钙4周，脱水石蜡包埋，行近远方向切片，厚度8 μm。HE染色，并行组织学观察。

1.5酶联免疫吸附法(ELISA)测定牙龈组织TNF-α和IL-1β的含量20 mg牙龈组织加入200 μL PBS，剪碎、冰上匀浆，组织悬液于低温离心机4 ℃离心4 000 r/min×5 min。取上清按照ELISA说明书检测组织TNF-α、IL-1β含量。

1.6Western blot检测MMP-2、MMP-9、TIMP-2、P38 MAPK和NF-κB蛋白表达10 mg牙龈组织加入100 μL RIPA和1 μL 100 mmol/L PMSF，剪碎、冰上电动匀浆。组织悬液于低温离心机4 ℃离心14 000 r/min×10 min。上清中的组织蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒检测。变性后蛋白样品(20 μg)经100 g/L SDS-多聚酰胺凝胶电泳后，湿转至聚偏乙烯二氟化物膜(PVDF)；PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉或BSA(TBST：25 mmmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mL/L Tween-20)室温封闭1 h后，加入一抗(MMP-2、MMP-9、TIMP-2、P38 MAPK和NF-κB)，工作液稀释比分别为1∶1 000(NF-κB)，其余为1∶200，4 ℃过夜；TBST漂洗5 min×5次；辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗(1∶5 000)室温孵育60 min；TBST漂洗5 min×5次；化学发光液(ECL)按说明书1∶1混合A、B两液滴加到PVDF膜，X线片曝光显影。Gel-Pro Analyzer 4.0 software(Media Cybernetics，Bethesda，MD)分析条带。

2结果

2.1盐酸小檗碱对大鼠牙周炎具有治疗作用假手术组大鼠双侧上颌第一磨牙牙龈组织无红肿、无牙周袋，触之无出血。牙周炎组大鼠双侧上颌第一磨牙牙龈组织糜烂、萎缩，龈缘有大量食物残渣，牙龈触之出血或有自发性出血现象，牙周袋形成、附着丧失及松动，给予盐酸小檗碱治疗后，牙周情况得到改善，牙龈红肿显著减轻，牙周袋消失或变浅，出血指数明显降低。

2.2盐酸小檗碱减轻大鼠牙周炎牙槽骨吸收显微X射线计算机断层扫描(micro X-ray computed tomography, μ-CT)结果显示，与假手术组相比，牙周炎组大鼠上颌牙槽骨吸收显著增加；给予150 mg/(kg·d)盐酸小檗碱治疗后，牙槽骨吸收较牙周炎组减轻(图1)。这提示盐酸小檗碱治疗可减轻牙槽骨的吸收。

图1盐酸小檗碱抑制大鼠牙槽骨吸收

Fig.1 Berberine inhibited alveolar bone loss in rat periodontitis (μ-CT)

A：假手术组(Sham)；B：牙周炎模型组(Periodontitis)；C：盐酸小檗碱治疗组(Periodontitis+Berberine)。

2.3盐酸小檗碱改善大鼠牙周组织情况HE染色结果显示，假手术组大鼠牙龈上皮完整，皮下结缔组织排列整齐无炎细胞浸润，牙槽骨骨质致密，无骨吸收陷窝；牙周炎组牙龈上皮受损，皮下结缔组织紊乱，炎性细胞浸润增多，牙槽骨疏松，骨吸收陷窝较多；盐酸小檗碱治疗组牙龈形态明显改善，炎性细胞浸润减少，牙槽骨骨质有所增加。这提示盐酸小檗碱治疗后可显著改善大鼠牙周组织学情况(图2)。

2.4牙龈组织TNF-α和IL-1β含量的变化ELISA检测结果显示，牙周炎模型组的牙龈组织TNF-α和IL-1β含量较假手术组明显增加(P<0.01)；盐酸小檗碱治疗后与牙周炎组比较，TNF-α和IL-1β显著降低(P<0.05，图3)。

图2盐酸小檗碱减轻牙周炎牙龈组织的退缩

Fig.2 Berberine improved the periodontal tissue destruction in rat periodontitis (HE, ×100)

A：假手术组(Sham)；B：牙周炎模型组(Periodontitis)；C：盐酸小檗碱治疗组(Periodontitis+Berberine)。

图3盐酸小檗碱降低大鼠牙龈组织TNF-α和IL-1β含量

Fig.3 Berberine decreased the levels of TNF-α and IL-1β in gingival tissue与假手术组(Sham)比较，**P<0.01；与牙周炎组(PD)比较，△P<0.05；△△P<0.01。PD：牙周炎模型组；B：盐酸小檗碱治疗。2.5牙龈组织MMP/TIMP蛋白表达水平Western blot检测结果显示，与假手术组相比，牙周炎组牙龈组织表达MMP-2、MMP-9显著增加(P<0.01)，而TIMP-2无明显变化；给予盐酸小檗碱治疗后，牙龈组织MMP-2、MMP-9明显低于牙周炎组(P<0.01)，TIMP-2较假手术组和牙周炎组显著升高(P均<0.05，图4)。这表明盐酸小檗碱可抑制MMP-2和MMP-9的表达，而相应提高TIMP-2的表达，减轻牙周组织细胞外基质的降解。

图4盐酸小檗碱对牙龈组织MMP-2、MMP-9和TIMP-2表达的影响

Fig.4 The effects of berberine on the expressions of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 in periodontitis

与假手术组(Sham)比较，*P<0.05，**P<0.01；与牙周炎组(PD)比较，△P<0.05，△△P<0.01。PD：牙周炎模型组；B：盐酸小檗碱治疗。

2.6牙龈组织P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平的变化Western blot检测结果显示，牙周炎组牙龈组织P38 MAPK/NF-κB磷酸化水平显著高于假手术组(P<0.01)；给予盐酸小檗碱治疗后，P38 MAPK和NF-κB磷酸化水平较牙周炎组均降低(P<0.01，图5)。这提示盐酸小檗碱对大鼠实验性牙周炎的炎症信号通路P38 MAPK/NF-κB具有明显的抑制作用。

图5盐酸小檗碱抑制牙周炎牙龈组织P38 MAPK/NF-κB的活化

Fig.5 Berberine reduced the activity of P38 MAPK/NF-κB in periodontitis

与假手术组(Sham)比较，**P<0.01；与牙周炎组(PD)比较，△△P<0.01。PD：牙周炎模型组；B：盐酸小檗碱治疗。

3讨论

牙周炎主要是革兰氏阴性厌养菌(如牙龈卟啉单胞菌等)对牙周组织所致慢性病理损害的结果，表现为病原菌与宿主相互作用所导致的免疫-炎症稳态的异常[12]。宿主toll样受体(toll-like receptors, TLRs)可识别牙周病原微生物，引起下游信号的活化，主要表现为TLR-2和TLR-4激活后，活化MyD-88依赖和非MyD-88依赖两条信号通路，引起P38 MAPK磷酸化增加，继而引起核转录因子NF-κB活化后入核启动靶基因的表达，最终导致致炎因子产生增多，引起局部剧烈的炎症反应[13]。这种剧烈的炎症反应导致牙槽骨的吸收和局部病灶的迁延不愈，其中局部感染和剧烈的炎症反应介导的MMPs/TIMPs比例失调——MMPs过度活化和TIMPs相对不足导致牙周组织的崩解，表现为牙槽骨吸收、牙龈退缩、牙周袋形成。

MMP是一类结构相似、功能不同的蛋白水解酶家族，可以消化细胞外所有的大分子物质，是主要调节细胞外基质降解的蛋白酶。MMP-2和MMP-9属于明胶酶，MMP-2主要由牙龈的表皮细胞和牙周膜成纤维细胞表达，以无活性的酶原(分子质量72 ku)，经剪切后形成活化型(62 ku)发挥作用[2]；MMP-9主要由浸润到牙周组织的炎性细胞产生，炎性细胞因子可增加对MMP-9的合成和分泌，前MMP-9(92 ku)经活化后形成活体形式(82 ku)，是牙周炎的重要生物学标志物[14]。MMP-2、MMP-9的过量表达与牙龈纤维基质瓦解程度密切相关。另外，TIMPs也是调控MMPs活化的重要因素，TIMPs可通过灭活活化的MMPs来减少细胞外基质的过度降解[15]。因此，调节MMPs/TIMP是目前治疗牙周炎的新策略。

盐酸小檗碱具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种药理作用，广泛应用于多种疾病的治疗。本研究应用盐酸小檗碱可改善牙周炎模型大鼠的牙周组织情况、减少了牙槽骨吸收，降低MMP-2、MMP-9的过度表达，提高了TIMP-2水平；进一步检测发现盐酸小檗碱抑制了促炎信号通路P38 MAPK/NF-κB的活化，减少了炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的生成。这提示盐酸小檗碱可能通过降低宿主的炎症反应及MMP的过度活化。这一发现为临床应用盐酸小檗碱治疗牙周炎提供了新的理论依据。

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(编辑国荣)

收稿日期：2015-11-17修回日期：2016-01-09

基金项目：国家自然科学基金青年项目(No.81202729)；陕西省自然科学基金基础研究项目(No.2012JM74012)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(No.xjj2012060)

通讯作者：李冬玲. E-mail: lidl@mail.xjtu.edu.cn

中图分类号：R781.4

文献标志码：A

DOI:10.7652/jdyxb201604016

Berberine regulates MMPs/TIMP via inhibition of P38 MAPK/NF-κB phosphorylation and anti-inflammation in rat experimental periodontitis

SUN Jun-yi1, ZHU Chun-hui1, LIU Jin1, LI Ang1, DONG Yan2, LI Dong-ling3

(1. Department of Periodontology, Stomatology Hospital of Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710004; 2. Editorial Office of the Chinese Journal of Dermatovenereology,the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University; Xi’an 710004;3. Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences,Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effects of berberine on matrix metalloproteinases/tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (MMPs/TIMPs) in rat periodontitis. MethodsAdult male Sprague-Dawley rats were subjected to thread ligation and porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) inoculation resulting in periodontitis. Berberine [150 mg/(kg·d)] or vehicle was administered by oral gavage for 4 weeks. Alveolar bone loss and soft-tissue destruction were determined by micro-computed tomography (μ-CT) and HE staining. The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) of gingival tissue were examined by ELISA. The expressions of MMP-2, MMP-9 and TIMP-2 as well as the phosphorylation of P38 MAPK and NF-κB were determined by Western blot. ResultsSignificant increases were observed in alveolar bone loss and periodontal soft-tissue destruction with higher levels of TNF-α, IL-1β and MMP-2/9 expressions and the activities of P38 MAPK and NF-κB in the experiment periodontitis group. Berberine of [150 mg/(kg·d)] not only improved the periodontal tissue and decreased alveolar bone loss, but also reduced the contents of TNF-α, IL-1β and MMP-2/9 and increased TIMP-2. In addition, berberine inhibited the phosphorylation of P38 MAPK/NF-κB. ConclusionBerberine protects against periodontal tissue damage via decreasing MMP-2 and MMP-9 expressions but increasing TIMP-2 expression, which may be induced by inhibition of P38 MAPK/NF-κB and the anti-inflammatory effect on rat periodontitis.

KEY WORDS:periodontitis; berberine; inflammation; matrix metalloproteinase (MMP)/ tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP); TNF-α; IL-1β; P38 MAPK/NF-κB

Supported by the Youth Project of National Natural Science Foundation of China (No.81202729), the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2012JM74012), and Fundamental Research Funds for the Central Universities (No.xjj2012060)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.r.20160618.2057.008.html(2016-06-18)