高原型藏绵羊附睾细胞外基质的组织化学研究

李　聪，袁莉刚，曲亚玲，鲁玉荣，路琪中

( 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 )



高原型藏绵羊附睾细胞外基质的组织化学研究

李聪，袁莉刚*，曲亚玲，鲁玉荣，路琪中

( 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 )

摘要：旨在探索高原型藏绵羊附睾细胞外基质相关蛋白的分布特征。应用Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS(pH 2.5)染色组织化学方法观察7只健康成年高原型藏绵羊附睾的组织结构特点，进而用免疫组织化学SP法观察层粘连蛋白(LN)、IV型胶原蛋白(Col IV)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)的分布特征。高原型成年藏绵羊附睾各部分管腔为柱状纤毛上皮，附睾尾间质胶原纤维和网状纤维较附睾头及附睾体明显增多。PAS反应显示附睾尾阳性强于附睾头和附睾体，AB-PAS反应显示附睾头和附睾尾的阳性强于附睾体。免疫组织化学结果显示，LN在组织中表达最强，HSPG次之，Col IV表达较弱，HSPG和LN的阳性表达差异不显著(P>0.05)。高原型成年藏绵羊附睾尾间质胶原纤维和网状纤维的分布较附睾头和附睾体多，附睾各部分中PAS的反应强弱与附睾上皮分泌功能的变化密切相关，附睾尾输精管的分泌功能增强；Col IV参与基膜的物质转运；HSPG与血-附睾屏障构成相关；LN与基膜的形成及其附睾中细胞外基质相关蛋白(ECM)的合成和分泌有关。

关键词：高原型藏绵羊；附睾；IV型胶原蛋白；层粘连蛋白；硫酸乙酰肝素蛋白多糖；组织化学

哺乳动物附睾位于睾丸的后外侧，根据其不同的结构和功能可分为近端的头部、细长的体部和远端的尾部3部分[1]，是储存、转运和成熟精子的器官，并具有分泌和吸收等功能[2]。附睾主要由睾丸输出管、附睾管、输精管组成。附睾各部分管壁主要由主细胞、基细胞、亮细胞和晕细胞及管周肌样细胞等组成的柱状纤毛上皮，由于有其独特的上皮细胞类型和功能特点，组织化学特征也有明显差异[3-4]。附睾中细胞外基质相关蛋白(Extracellular matrix，ECM)为附睾的生理结构基础，不仅在黏附细胞和保持组织的正常形态中起作用，且对细胞形态、功能乃至生长、分化均起重要的调节作用[5]。

附睾中的细胞外基质由基膜和间质等分泌的蛋白、多糖等构成，主要包括胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ (Type Ⅳ Collage，Col Ⅳ)、层粘连蛋白(Laminin，LN)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(Heparan sulfate proteoglycan，HSPG)等，主要分布于附睾内部分固有层、上皮和间质区[6]。Col Ⅳ位于整个基膜的致密层，含量丰富，属于非原纤维胶原蛋白，由6型α肽链组成独特的异源三聚体螺旋结构，能提供结构支持以调节细胞的黏附、迁移和存活[7]；HSPG是ECM分泌较多的一种蛋白多糖，由5个区域组成，在基膜中分布较广泛，可自我装配成低聚物，参与机体的生长发育，并在生长发育过程中维持很多组织的稳定性[8]；LN是一种异源三聚体糖蛋白，由α、β、γ 3种肽链组成，广泛存在于基膜中，能促进细胞黏附、调节细胞形态、分化及细胞移动[8]。研究表明，小鼠在附睾各部分管壁基膜上有Ⅳ型胶原和LN的分布[9]。A.Hadley等[10]表明啮齿类动物的睾丸中Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖及纤维粘蛋白与生精小管、支持细胞和精原细胞形成了基膜。牦牛犊牛睾丸ECM相关蛋白免疫组化研究显示，LN、Col Ⅳ和HSPG在生精小管固有膜和肌样细胞均有表达，且强弱差异显著[11]，而在老龄牦牛睾丸组织Col Ⅳ分泌增加且胶原纤维合成增强，LN和HSPG的显著降低可能影响leydig细胞合成分泌能力[12]，可见高原低氧环境下，Col Ⅳ、HSPG和LN的分布影响牦牛等高原动物生殖繁育的调控。藏绵羊是中国3大原始绵羊品种之一，对青藏高原的环境有很强的适应性，能在气候寒冷、牧草生长期短、空气稀薄的恶劣环境下生活并繁育后代，是当地畜牧业经济中重要的畜种。高原低氧环境影响藏绵羊的生殖繁育功能，附睾细胞外基质在生殖繁育过程中起到重要的调控作用。目前国内外对于藏绵羊附睾细胞外基质组织化学特征及相关蛋白的定位及分布研究尚未见报道。本研究采用组织化学方法对高原地区藏绵羊附睾组织中ECM相关纤维(胶原纤维、网状纤维)、糖(糖原、酸性粘多糖及中性粘多糖)以及蛋白(LN、Col Ⅳ和HSPG)等成份的分布特征进行比较观察，为进一步研究高原型藏绵羊睾丸局部生精微环境的构成及发育特点提供参考资料。

1材料与方法

1.1试验动物

成年藏绵羊附睾样品采自青海省西宁市屠宰场，共7对，通过睾丸摘除手术采集。以4%中性福尔马林溶液固定3 d后备用。

1.2主要试剂

IV型胶原兔抗鼠多克隆抗体(bs-4595R)、LN兔抗鼠多克隆抗体(bs-8561R)和HSPG兔抗鼠多克隆抗体(bs-5072R)均购自北京博奥森生物技术有限公司；免疫组化染色试剂盒(sp-0023)美国ZYMED公司生产；DAB显色试剂盒(ZLI-9018)和(ZLI-9502)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3切片制备

新鲜组织样品称重测量，记录解剖数据，4%中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，连续切片(片厚5 μm)，相邻切片分为8套，其中3套分别用于Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)、LN和HSPG免疫组织化学SP法染色，剩5套用于组织化学Masson’s、Gomori’s、过碘酸雪夫染色(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)、阿利新蓝-过碘酸雪夫氏染色法(Alcian blue-periodic acid schiff，AB-PAS，pH 2.5)及阴性对照。

1.4组织化学染色法

切片脱水、脱蜡后分别进行Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS染色，之后继续进行脱水、透明，然后封片、观察、拍照。Masson’s三色(亮绿)染色，胶原纤维呈现蓝绿色，细胞核呈现灰黑或灰蓝色，红细胞呈红色；Gomori’s银染显示网状纤维为灰色，苏木素-伊红复染后呈棕红色；PAS染色显示糖原及其他PAS反应阳性物质均呈阳性，细胞核呈蓝色；AB-PAS(pH2.5)染色显示酸性黏液物质呈蓝色，中性黏液物质呈红色，混合呈紫红色，细胞核呈浅蓝色。

1.5免疫组织化学SP法检测Col Ⅳ、LN和HSPG的分布

免疫组织化学SP法进行染色，切片脱水、脱蜡后，进行高温高压抗原修复，后加一抗，一抗用Col Ⅳ、LN和HSPG 3种多克隆抗体，Col Ⅳ按1∶400比例稀释，LN和HSPG均按1∶600比例稀释，阴性对照组用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗(Col Ⅳ、LN和HSPG)，4 ℃过夜，后孵育、清洗、显色、脱水、透明、封片。然后显微镜下观察、照相。

1.6图像分析

光镜下观察免疫组织化学切片，随机选取5张，每组切片中在400倍显微镜(Olympus)下进行拍照，每张切片采集5个视野，用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，测定阳性反应物的平均光密度，并用SPSS 21.0统计软件对数据进行单因素方差分析，结果用“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2结果

2.1高原型藏绵羊附睾纤维及糖成份的组织化学特征

光镜下，高原型藏绵羊各附睾管上皮均可见3～4层上皮细胞，大量成熟精子分布于腔面，管周肌样细胞胞核呈长梭形围绕各附睾管固有膜外周(图1A)；间质结缔组织发达，富含胶原纤维(图1A～C)、网状纤维和血管(图1D～F)，且附睾头和附睾体间质胶原纤维(图1A，B)和网状纤维(图1D，E)较少，附睾尾间质胶原纤维(图1C)和网状纤维(图1F)明显增多；附睾头和附睾体管腔内纤毛较长(图1A，B)，而附睾尾管腔内纤毛较短，变为刷状缘结构清晰(图1C)。PAS染色显示各附睾管上皮固有膜、间质毛细血管壁、管周肌样细胞及腔面精子紫红色糖原阳性条带明显(图1G～I)，附睾尾刷状缘呈强阳性(图1I)，且附睾尾PAS阳性反应强于附睾头和附睾体(图1G～I)。AB-PAS染色显示各部分细胞核为蓝色，附睾各部分毛细血管内皮细胞、柱状上皮下固有膜、上皮游离缘呈深紫红色(图1J～L)，附睾头和附睾尾管周肌样细胞呈深紫红色(图1J，L)，且其AB-PAS阳性反应强于附睾体(图1J～L)。

2.2高原型藏绵羊附睾组织中Col IV、LN和HSPG的分布

高原型藏绵羊附睾细胞外基质相关蛋白免疫组织化学结果显示，Col IV在各附睾管上皮细胞、血管内皮细胞、纤毛和精子呈中等阳性表达，管周肌样细胞呈弱阳性表达(图2A～C)，其中附睾头和附睾体的阳性表达率高于附睾尾，附睾头和附睾体的阳性表达率差异较小(表1)；HSPG在各附睾管上皮细胞、血管内皮细胞和纤毛呈强阳性表达，管周肌样细胞呈弱阳性表达，附睾头和附睾体腔面精子呈强阳性表达，附睾尾腔面精子呈弱阳性表达(图2D～F)，但附睾体的阳性表达率高于附睾头和附睾尾，附睾头和附睾尾的阳性表达率差异较小(表1)；LN在各附睾管细胞、血管内皮细胞、纤毛和精子呈强阳性表达，管周肌样细胞呈弱阳性表达(图2G～I)，但附睾头和附睾体的阳性表达率高于附睾尾，附睾头和附睾体的阳性表达率差异较小(表1)；各蛋白阴性对照无表达(图2J～L)。

统计结果表明，LN、HSPG和Col Ⅳ在附睾头和附睾尾的表达规律相一致。LN在组织中表达最强，HSPG次之，Col Ⅳ表达较弱，HSPG和LN的阳性表达差异不显著(表1，P>0.05)；而HSPG在附睾体组织中表达最强，LN次之，Col IV表达较弱，HSPG和LN的阳性表达差异不显著(表1，P>0.05)。

3讨论

3.1附睾头、体、尾胶原纤维和网状纤维分布的比较分析

附睾细胞外基质是基膜的重要组成部分，主要包括Col Ⅳ、HSPG和LN等。研究表明小鼠附睾管周围存在Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原纤维，Ⅰ型胶原纤维存在于附睾管外围，并且其含量从附睾头至附睾尾逐渐增加[13]，本研究中各附睾管外围胶原纤维丰富，附睾尾胶原纤维的分布较附睾头和附睾体明显增多，可能与胶原良好的韧性促进附睾的收缩功能运送精子到输精管有关。研究发现网状纤维主要由Ⅲ型胶原蛋白构成，常伴其他类型的胶原、蛋白多糖和糖蛋白。网状纤维细而有分支，穿行于细胞之间，共同构成网状支架[14]。本研究中各附睾管外围网状纤维的分布细而密，相互构成网络，并且其分布基本与胶原纤维一致。

BC.基细胞；CA.纤毛；CF.胶原纤维；ED.附睾管；G.糖原；MC.主细胞；PC.管周肌样细胞；RF.网状纤维；SD.输精管；SZ.精子；TED.睾丸输出管；V.血管. 下同。 A、D、G、J.成年高原型藏绵羊睾丸输出管；B、E、H、K.成年高原型藏绵羊附睾管；C、F、I、L.成年高原型藏绵羊输精管。A～C.Masson’s染色；D～F.Gomori’s染色；G～I.PAS染色；J～L.AB-PAS染色BC.Basal cells; CA.Cilia; CF.Collagen Fiber; ED.Epididymal duct; G.Glycogen; MC.Main cells; PC.Peritubular Myoid cells; RF.Reticular fiber; SD.Seminiferous duct; SZ.Spermatozoon; TED.Testicular efferent duct; V.Vessel. The same as below. A，D，G，J.The structure of testicular efferent duct in Plateau Tibetan sheep；B，E，H，K.The structure of epididymal duct in Plateau Tibetan sheep；C，F，I，L.The structure of seminiferous duct in Plateau Tibetan sheep. A-C.Masson’s staining；D-F.Gomori’s staining；G-I.PAS staining; J-L.AB-PAS staining图1　高原型藏绵羊附睾Masson’s、Gomori’s、PAS和AB-PAS组织化学染色 (bar=20 μm)Fig.1　The histochemistry of Masson’s,Gomori’s,PAS and AB-PAS staining in epididymis of Plateau Tibetan sheep (bar=20 μm)

A.Col IV在成年高原型藏绵羊睾丸输出管中的表达；B.Col IV在成年高原型藏绵羊附睾管中的表达；C.Col IV在成年高原型藏绵羊输精管中的表达；D.HSPG在成年高原型藏绵羊睾丸输出管中的表达；E.HSPG在成年高原型藏绵羊附睾管中的表达；F.HSPG在成年高原型藏绵羊输精管中的表达；G.LN在成年高原型藏绵羊睾丸输出管中的表达；H.LN在成年高原型藏绵羊附睾管中的表达；I.LN在成年高原型藏绵羊输精管中的表达；J.成年高原型藏绵羊睾丸输出管(阴性对照)；K.成年高原型藏绵羊附睾管(阴性对照)；L.成年高原型藏绵羊输精管(阴性对照)A.The expresstion of Col IV in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;B.The expresstion of Col IV in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;C.The expresstion of Col IV in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep;D.The expresstion of HSPG in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;E.The expresstion of HSPG in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;F.The expresstion of HSPG in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep; G.The expresstion of LN in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;H.The expresstion of LN in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;I.The expresstion of LN in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep;J.The control of expresstion in testicular efferent duct of Plateau Tibetan sheep;K.The control of expresstion in epididymal duct of Plateau Tibetan sheep;L.The control of expresstion in seminiferous duct of Plateau Tibetan sheep图2　高原型藏绵羊附睾的免疫组织化学染色(bar=20 μm)Fig.2　The immunohistochemical staining in epididymidis of Plateau Tibetan sheep(bar=20 μm)

3.2附睾头、体、尾PAS和AB-PAS染色阳性反应区域的比较分析

附睾是精子成熟、保护、运输和贮存的部位，在哺乳动物生殖生育中起着重要作用[15]。附睾上皮不仅需要大量的营养物质，也会分泌一些因子和颗粒，对精子成熟起重要作用。C.Moore等[16]研究表明美国短吻鳄睾丸组织PAS和AB-PAS反应显示基膜和管周肌样细胞呈阳性，并且PAS和AB-PAS反应呈阳性的位置与ECM一致。研究表明大白鼠附睾头、体、尾PAS反应阳性逐渐增强是因为亮细胞的数量逐渐增多导致[17]。研究表明亮细胞是附睾上皮分泌周期中一种细胞过渡状态，大鼠附睾尾亮细胞含量较多，其PAS反应较强[18]，本研究中成年藏绵羊附睾尾PAS反应阳性强于附睾头和附睾体，附睾头和附睾尾AB-PAS反应阳性强于附睾体，提示PAS反应的强弱与亮细胞的数量有直接关系。本研究中附睾尾PAS和AB-PAS反应较强，与亮细胞数量表现一致，附睾上皮PAS的反应强弱与附睾上皮分泌功能的变化密切相关，表明藏绵羊附睾尾的分泌功能强于附睾头和附睾体，本研究中附睾尾以输精管为主，输精管分泌功能的增强，对于精子成熟及输送等生理功能的影响需进一步研究证实。

表1高原型藏绵羊附睾Col Ⅳ、LN和HSPG的平均光密度

Table 1The average optical density of Col Ⅳ，LN and HSPG in epididymitis of Plateau Tibetan sheep

组别GroupColⅣHSPGLN附睾头Caputepididymitis0.0313±0.00390.0495±0.00460.0511±0.0041附睾体Corpusepididymitis0.0339±0.00290.0582±0.00640.0523±0.0035附睾尾Caudaepididymitis0.0214±0.00210.0435±0.00350.0442±0.0033

3.3附睾细胞外基质Col Ⅳ、HSPG和LN在附睾头、体、尾中分布的比较分析

在机体发育的过程中Col Ⅳ是高度特化的细胞外基质，主要存在于各附睾管的基膜[19]，形成了基膜的力学结构，为细胞之间黏附、转移和存活提供了结构基础[9]，对基质和细胞间物质交换具有筛板作用[20]。研究表明，Col Ⅳ 主要在上皮或内皮细胞合成，是上皮细胞和内皮细胞等生长的依附和支架。血管的生成需要多种血管基膜成分的参与，Col Ⅳ既可以促进血管的生成，也可以抑制血管的生成[21]。本研究中Col Ⅳ在成年藏绵羊附睾各部分上皮细胞和血管内皮细胞中呈中等阳性表达，提示Col Ⅳ与血管、基膜均有密切的关系。研究报道，基膜可以作为滤过屏障使细胞黏附和转移，并且使很多细胞因子聚集在此[11]，胶原作为细胞黏附的良好基质，其含量有决定性的作用，可直接影响细胞的基本结构、形态、增殖和代谢的变化[20]，本研究中Col Ⅳ在基膜有阳性表达，提示Col Ⅳ与基膜的物质转运密切相关。研究表明，主细胞参与血-附睾屏障[22]，本研究中，Col Ⅳ在主细胞中有Col Ⅳ阳性表达，但表达较弱，因此Col Ⅳ与血-附睾屏障构成及作用的相关性有待于进一步研究。HSPG是发现最早的一种ECM，广泛存在于基膜中[23]，不仅能结合基膜的LN、Col Ⅳ等多种成分，而且还可以与基膜外的ECM等多种成分结合。在脉管系统和上皮细胞中HSPG位于基膜或它与Ⅳ型胶原、LN等其他一些组分构成基膜[24]。本研究中HSPG在成年藏绵羊附睾各部分的整个上皮均为强阳性表达，基细胞、主细胞及血管内皮细胞也可见强阳性表达，提示HSPG可能参与附睾上皮及血管基膜的构成。研究表明基细胞主要有吸收、吞噬和精子的免疫监视作用[25-27]，提示HSPG可能与各附睾管的吸收功能有关，也可能参与维持各附睾管内的酸性环境，利于精子的成熟及附睾的免疫应答。研究表明，主细胞参与血-附睾屏障[22]，HSPG可以和Ⅳ型胶原和LN构成基膜[28]，本研究中，HSPG与Col Ⅳ、LN的表达规律基本一致，提示HSPG可与其他多种ECM成分相互作用，与血-附睾屏障构成及作用密切相关。LN作为一种非胶原蛋白成分，是基膜中最丰富的一种ECM[29]。研究表明，LN的构造及稳定性与Col Ⅳ和HSPG等有关[30]。在胚胎发育后期，LN通过蛋白多糖和聚集蛋白的间接作用与Ⅳ胶原蛋白、HSPG和聚集蛋白等相互作用形成成熟的基膜[31]。在果蝇中，少量的LN使基膜不完整，从而导致ECM的排列紊乱[32]。本研究中，LN在各部分附睾基膜和基细胞中表达量较高，提示LN可能与基膜的形成有关。LN在成年藏绵羊附睾各部分上皮均为强阳性表达，研究表明，PAS和AB-PAS阳性反应的蛋白多糖和糖蛋白多存在于结缔组织、黏液和基膜中，睾丸生精小管基膜的基本成分，如LN是PAS特殊反应阳性糖蛋白[33]，提示各附睾管基膜基本成分LN可能也与PAS合成及分泌相关。LN可以促进上皮细胞与Ⅳ型胶原的黏连[5]，牦牛犊牛睾丸管周肌样细胞可能与Ⅳ型胶原及LN的合成和分泌有关[11]。本研究中，LN在附睾管周肌样细胞中也有表达，表明藏绵羊附睾各段管周肌样细胞同样具有分泌LN的功能；且在藏绵羊附睾血管内皮细胞为强阳性表达，提示LN可能在调节血管的生长和完整性方面有重要作用。

4结论

高原型成年藏绵羊附睾尾间质胶原纤维和网状纤维的分布较附睾头和附睾体多，附睾各部分PAS的反应强弱与附睾上皮分泌功能的变化密切相关，附睾尾输精管的分泌功能增强；Col Ⅳ参与基膜的物质转运；HSPG与血-附睾屏障构成相关；LN与基膜的形成及其他ECM的合成和分泌有关。

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(编辑程金华)

The Histochemical Study of Extracellular Matrix in Plateau Tibetan Sheep Epididymis

LI Cong，YUAN Li-gang*，QU Ya-ling，LU Yu-rong，LU Qi-zhong

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

Abstract:To explore the distribution of extracellular matrix proteins of epididymis in Plateau Tibetan sheep.The histochemistry of Masson’s，Gomori’s，PAS and AB-PAS(pH 2.5)stainning were used to study the microstructure of epididymis in 7 Plateau Tibetan sheep，also the distribution of the laminin (LN)，type IV collagen (Col IV) and heparan sulfate glycoprotein (HSPG) was identified by SP immunohistochemical method.The observations made with the light microscope showed that the epithelium of epididymal ducts were columnar ciliated epithelium and the cauda was more abundant with collagen and reticular fiber than in the caput and the corpus，and as well as the PAS positive reaction in the cauda，but AB-PAS positive reaction showed that the caput and the cauda were stronger than the corpus.In addition，immunostaining analysis appeared that LN was strongly presented in the epididymis，the relative expression of HSPG was lower than LN，and Col IV was weakly expressed，but the distribution of LN and HSPG without statistical differences in epididymis (P>0.05).Taken together，the collagen and reticular fiber were more abundant in cauda than caput and corpus in Plateau Tibetan sheep epididymis，and the intensity of the PAS reaction was companied with the changes of the secretion function of epithelium，the Col IV distribution of ECM proteins was participated in basement membrane transport，but HSPG was related to the blood-epididymis barrier，and the distribution of LN may closely related with the membrane construction and secretion the of other extracellular matrix proteins in epididymal ducts.

Key words:Plateau Tibetan sheep；epididymis；type IV collagen；laminin；heparan sulfate proteoglycan；histochemistry

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.023

收稿日期：2015-09-10

基金项目：甘肃省财政厅基本科研业务项目(2012)；国家自然科学基金项目(31160488)；甘肃省自然科学研究基金(145RJZA223)

作者简介：李聪(1991-)，女，青海大通人，硕士生，主要从事动物发育生物学研究，E-mail:393803599@qq.com,Tel:0931-7631229 *通信作者：袁莉刚，E-mail：yuan2918@126.com

中图分类号：S852.16+5；S826

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)04-0820-08