地榆对MRSA生物被膜形成的抑制作用

王馨，陈菲，王龙，谢鲲鹏，谢明杰

( 辽宁师范大学生命科学学院，辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

地榆对MRSA生物被膜形成的抑制作用

王馨†，陈菲†，王龙，谢鲲鹏，谢明杰Δ

( 辽宁师范大学生命科学学院，辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室，辽宁 大连 116081)

目的 研究地榆对MRSA41577菌株生物被膜(bacterial biofilm，BF)的抑制作用。方法 采用刚果红法和结晶紫半定量法检测供试菌株BF的形成能力；采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定地榆对MRSA41577BF形成和成熟BF的抑制作用，以及地榆与万古霉素联用对MRSA41577成熟BF的抑制作用。结果 地榆对MRSA41577BF形成和成熟BF有显著的抑制作用，其抑制MRSA41577BF形成的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)分别为1 mg/mL和8 mg/mL。抑制MRSA41577成熟BF的MIC为4 mg/mL。当用亚抑菌浓度的地榆与万古霉素联合作用后，可显著提高成熟BF对万古霉素的敏感性。万古霉素的浓度≤64 μg/mL时，对MRSA41577成熟BF没有破坏作用，当1/4MIC的地榆与4 μg/mL万古霉素联用，即可对供试菌株成熟BF有抑制作用。结论 地榆对MRSA41577BF形成有显著的抑制作用，其作用机制与地榆破坏BF结构，使万古霉素等抗生素渗透到BF内来完成杀菌作用有关。

地榆；MRSA；生物被膜

细菌耐药性问题日趋严峻，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)以其多重耐药性特点，严重危害人类和畜禽的健康。有报道显示，在临床感染中，MRSA感染占到了60%～80%，由MRSA引起的脓毒血症及休克等严重并发症，死亡率高达63.1%[1-2]。关于MRSA的耐药机制，目前认为细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)的形成是导致其耐药的主要原因之一[3]。BF的形成可使细菌对药物的敏感性降低，造成临床上可以用于治疗MRSA感染性疾病的抗生素种类日趋减少。因此，获得抑制菌体BF形成的药物，是解决MRSA临床感染的有效途径之一。目前研究显示，中药及其有效单体化合物，如地榆、五倍子、黄芩素以及和厚朴酚等对BF形成有显著的抑制作用[4-5]。本文主要研究地榆对MRSA BF的影响，旨在为开发抗BF感染药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株：MRSA41577和1828由吉林医大二院实验室提供。阴性对照菌株：StaphylococcusepidermidisATCC12228购于中国医学菌种保藏中心。

1.1.2 主要实验药品：地榆由辽宁师范大学中药现代化实验室提供。氯代三苯基四氮唑(TTC)、万古霉素和刚果红等购于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 地榆粗提物的制备：称取一定量的地榆，用索氏提取器以95%的乙醇热回流提取8 h后将提取液浓缩制成干粉。精确称取一定量的干粉，将其用无水乙醇配制成浓度为350 mg/mL的母液，0.22 μm滤器过滤后备用。

1.2.2 供试MRSA菌株BF形成能力的定性和半定量检测方法：定性检测：采用刚果红法测定[6]。多糖细胞间粘附素(PIA)是细菌BF的主要成分，对维持BF的稳定发挥重要作用。刚果红可与PIA结合并呈现颜色反应。首先将在含0.5% 葡萄糖的LB液体培养基中培养至对数期的供试菌株和阴性对照的菌悬液，用玻璃棒点接种于刚果红平板上，于37 ℃温箱中培养24 h后观察菌落颜色。结果判断：菌落为黑色、光亮和干燥的为产BF菌株；菌落为白色或红色为不产BF菌株。半定量检测：采用结晶紫法测定[7]。结晶紫半定量法是采用双波长法，通过测定结晶紫与PIA的结合量，来衡量菌体产BF的能力。首先于96孔板中加入200 μL培养至对数期的供试菌株和阴性对照的菌悬液(106cfu/mL)，37 ℃静置培养24 h后，用酶标仪测定595 nm下菌体的OD值。其次，小心将各孔中的上清液除去，PBS缓慢冲洗3次后，向每孔中加入200 μL 99%的甲醇固定10 min，除去甲醇，再在每孔中加入200 μL 2% 的结晶紫染色8 min，然后用无菌水冲洗至流水无色；待干燥后，每孔加入200 μL乙醇:丙酮(体积比=80:20)溶剂悬浮菌体，用酶标仪测定570 nm下菌体的OD值。以0.5% 葡萄糖的LB培养基为空白对照。每组设置3个复孔，取平均值。产膜结果判断[8]：OD570/OD595< ODC，为产BF阴性菌株；ODC4ODC，为产BF强菌株。ODC=OD570阴性对照+ 3SD(SD为标准偏差)；OD570=OD570nm实验组-OD570nm空白组；OD595=OD595nm实验组-OD595nm空白组。

1.2.3 地榆抑制MRSA41577BF形成的MIC和MBC的测定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)[9]。于96孔板中，分别加入100 μL用含0.5%葡萄糖的LB培养基培养至对数期的MRSA 41577菌悬液(106cfu/mL)，再加入10 μL不同浓度的地榆药液，使其终浓度分别为0.25、0.5、1、2、4和8 mg/mL，37 ℃下培养24 h后，于各孔中加入20 μL 0.2%的TTC，避光培养4 h，观察每孔颜色变化，实验重复3次，取平均值，以不加药物组为空白对照。MIC为没有红色还原物甲臢产生的最低药物浓度。最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration，MBC)的测定：从大于MIC的各孔中，分别吸取10 μL涂布于含0.5%葡萄糖的LB固体培养基，37 ℃培养24 h后观察菌体的生长情况。MBC为平板上没有菌体生长的最低药物浓度。

1.2.4 地榆抑制MRSA 41577成熟BF的MIC和MBC的测定：用96孔板将MRSA培养3 d后即可得到菌体成熟的BF。将形成的BF用PBS缓慢冲洗3次后，分别加入200 μL含0.5%葡萄糖的LB固体培养基和20 μL不同浓度的地榆药液，使其终浓度分别为1、2、4、8、16、32和64 mg/mL，然后按照1.2.3的方法测定地榆对MRSA41577成熟BF的MIC及MBC。

1.2.5 地榆与万古霉素的协同作用对MRSA 41577成熟BF的影响[10]：将在96孔板中培养3 d的成熟BF，用PBS洗3次后，在各孔中分别加入等量的万古霉素和地榆，使万古霉素的终浓度分别为0、2、4、8、16、32和64 μg/mL，地榆的终浓度分别为0、1/8 MIC、1/4MIC和1/2MIC，37 ℃静置培养24 h后，TTC法测定2种药物的协同作用，每组设置3个复孔，取平均值。

2 结果

2.1 供试MRSA菌株产BF的测定结果 刚果红实验结果显示(图1)，2种供试菌株的菌落颜色均为黑色，表明2者均可产生BF。结晶紫半定量法实验结果显示，3次检测所得的ODC为(0.85±0.006)，供试菌株MRSA41577和1828的OD570/OD595值分别为(3.08±0.008)和(2.80±0.005)，均大于3ODC，表明2者均为产BF较强菌株。本文以产膜能力强的MRSA41577作为后续的实验菌株。

图1 刚果红平板实验检测供试菌株产BF的能力1.阴性对照；2.MRSA1828；3.MRSA41577Fig.1 Biofilm-production ability of tested strains tested by Congo red agar1.negative control;2.MRSA1828；3.MRSA41577

2.2 地榆抑制MRSA41577 BF形成的MIC和MBC 实验结果显示，随着药物浓度的增加，地榆对MRSA41577BF形成的抑制作用逐渐增强(表1)，其MIC为1 mg/mL。地榆也具有杀菌作用，其对MRSA41577的MBC为8 mg/mL。

表1 地榆抑制MRSA41577BF形成的MIC和MBC

“+++”为红色，“++”为粉红色，“+”为粉色，“-”为无色

2.3 地榆抑制MRSA41577菌株成熟BF形成的MIC和MBC 实验结果显示，地榆对MRSA41577菌株成熟BF有较强的抑制作用，且呈浓度剂量依赖(见表2)，其MIC为4 mg/mL。当地榆浓度小于32 mg/mL时不能杀死BF内细菌。

表2 地榆抑制MRSA41577成熟BF形成的MIC和MBC

“+ + +”为红色；“+ +”为粉红色；“+”为粉色；“-”为无色

2.4 地榆和万古霉素联用对MRSA41577成熟BF的抑制作用 实验结果显示，当万古霉素的浓度≤64 μg/mL时，对MRSA41577菌株成熟BF没有破坏作用，但与亚抑菌浓度的地榆联合作用后，成熟BF对万古霉素的敏感性显著提高(见表3)。其中1/4MIC的地榆与4 μg/ml万古霉素联用时，即可对供试菌株成熟BF有抑制作用。表明地榆可破坏MRSA41577BF的结构，促进万古霉素渗透到膜内完成其杀菌作用。

表3 地榆和万古霉素的协同作用

“+”为红色；“-”为无色

3 讨论

BF的形成是导致MRSA耐药的主要原因[11-12]，也是造成临床上慢性持续感染的主要原因[13]。地榆是我国传统的中药材，是蔷薇科地榆属的多年生草本植物，其含有多种化学成分，包括鞣质、三萜皂苷、黄酮、甾体等[14-15]。本实验结果显示，地榆对MRSA41577BF的形成及成熟BF均有较强的抑制作用，其中抑制MRSA41577BF形成的MIC和MBC分别为1和8 mg/mL。抑制成熟BF的MIC 4 mg/mL。

目前临床上将万古霉素作为MRSA治疗的“最后防线”。但近年来发现，由于细菌BF的形成，细菌对万古霉素的敏感性降低[16-17]。本实验结果显示，当万古霉素的浓度≤64 μg/mL时，其对MRSA41577成熟BF没有破坏和杀灭作用，但当与地榆联合应用时,4 μg/mL的万古霉素即可对MRSA41577成熟BF起到杀菌作用。其原因可能是菌体形成的BF，使万古霉素不能渗透到菌体内部而发挥作用。而地榆可破坏BF的结构，促进万古霉素渗透到成熟BF内完成杀菌作用。

综上所述，地榆能显著抑制MRSA 41577BF的形成，其作用机制与通过破坏BF的结构，使万古霉素等抗生素渗透到成熟BF内来完成杀菌作用有关。关于地榆抑制MRSA BF形成的其他作用机制尚有待于进一步的研究。

[1] 于旭红,王冬,王睿.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的研究进展[J].中国临床药理学杂志，2011,27(4):306-310.

[2]冯明.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测与耐药性的研究进展[J].中国医药导报,2012,9(2):8-9.

[3]Hφiby N, Bjarnsholt T, Givskov M, et al.Antibiotic resistance of bacterial biofilms[J].In J Antimicrob Agents, 2010, 35(35):322-332.

[4]Chen XL, Shang F, Meng YJ, et al.Ethanol extract of Sanguisorba officinalis L.inhibits biofilm formation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in an ica-dependent manner[J].J Dairy Sci, 2015, 98(12):8486-8491.

[5]乔瑞红, 谢鲲鹏, 谢明杰.和厚朴酚抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物被膜形成[J].微生物学报, 2016,56(8):1266-1276.

[6]Kaiser TD, Pereira EM, Dos Santos KR, et al.Modification of the Congo red agar method to detect biofilm production by Staphylococcus epidermidis[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2013 Mar;75(3):235-239.

[7]Wang Y, Wang T, Hu JJ, et al.Anti-biofilm activity of TanReQing, a Traditional Chinese Medicine used for the treatment of acute pneumonia[J].J Ethnopharmacol, 2010, 134(1):165-170.

[8]Stepanovic S, Vukovic D, Dakic I, et al.A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation[J].J Microbiol Methods, 2000, 40(2):175-179.

[9]Lee DD, Lee EY, Jeong SH, et al.Evaluation of a Colorimetric Broth Microdilution Method for Antimicrobial Susceptibility Testing Using2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride[J].Korean J Clin Microbiol, 2007,10(1):49-53.

[10]邹丹, 谢鲲鹏, 王海婷,等.鹰嘴豆芽素A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌外排系统的抑制作用[J].微生物学报,2014,54(10):1204-1211.

[11]Ghasemian A, Peerayeh SN, Bakhshi B, et al.Biofilm Formation in Multi-Drug Resistant Staphylococcus Aureus Isolates from Hospitalized Patients[J].Bangladesh Bangladesh J Infect Dis, 2014, 1(2):27-31.

[12]Im GJ, An YS, Choi J,et al.Analysis of Bacterial Biofilms on a Cochlear Implant Following Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus Infection[J].J Audiol Otol,2015,19(3):172-177.

[13]Worthington RJ, Richards JJ, Melander C.Small molecule control of bacterial biofilms[J].Org Biomol Chem,2012,10(37):7457-7474.

[14]Anna GG, Ewa WB, Wiestawa B, et al.Chemical Composition, Antioxidant and Antimicrobial Activities of Sanguisorba officinalis L.Extracts[J].Pharmaceut Chem J,2016,50(4):244-249.

[15]Harriott MM, Noverr MC.Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation[J].Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(9):3746-3755.

[16]Antoci V, Adams CS, Parviz J, et al.The inhibition of Staphylococcus epidermidis biofilm formation by vancomycin-modified titanium alloy and implications for the treatment of periprostheticinfection[J].Biomaterials, 2008, 29(35):4684-4690.

[17]Adam C, Zmora P, Matkowski A, et al.Tannins from sanguisorba officinalis affect in vitro rumen methane production and fermentation[J].J Anim Plant Sci, 2016,26(1):54-62.

(编校：王俨俨)

Inhibitory effects ofSanguisorbaofficinalisL. on MRSA biofilms formation

WANG Xin†, CHEN Fei†, WANG Long, XIE Kun-Peng, XIE Ming-JieΔ

(School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo investigate inhibitory effects ofSanguisorbaofficinalisL.on biofilms of MRSA41577.MethodsCongo red agar method and crystal violet semi-quantitative method were used to detect the biofilms-forming ability of tested strains; TTC assay was used to detect inhibitory effects ofSanguisorbaofficinalisL.on biofilms formation and mature biofilms of MRSA41577,as well as effects ofSanguisorbaofficinalisL.in combination with vancomycin on mature biofilms of MRSA41577.ResultsSanguisorbaofficinalisL.showed significant inhibitory both on biofilms formation and mature biofilms, minimum inhibitory concentration(MIC) and minimal bactericidal concentration(MBC) of biofilms formation were 1 mg/mL and 8 mg/mL,MIC of mature biofilms was 4 mg/mL.The sensitivity of mature biofilms to vancomycin was greatly increased whenSanguisorbaofficinalisL.was combined with vancomycin with subinhibitory concentrations.SanguisorbaofficinalisL.at 1/4 MIC can inhibit mature biofilms when combined with vancomycin at 4 μg/mL, while vancomycin didn’t show inhibitory effects on mature biofilms when concentrations were below 64 μg/mL.ConclusionSanguisorbaofficinalisL.has significant inhibitory on biofilms formation, the mechanism may be related toSanguisorbaofficinalisL.destroyed biofilms and make vancomycin penetrate into the biofilms to finish the bactericidal activity.

SanguisorbaofficinalisL.; MRSA; bacterial biofilm

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.006

辽宁省教育厅科学研究一般项目(L201683675)；辽宁省自然科学基金项目(201602462)

王馨，女，学士在读，研究方向：生物科学，E-mail：974150173@qq.com；陈菲，共同第一作者，女，硕士在读，研究方向：微生物学，E-mail：739420029@qq.com；谢明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

R285；Q939.92

A