培土生金法对慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌细胞增殖与凋亡的影响

宋璟，孙志佳

（广州中医药大学，广东广州　510405）



培土生金法对慢性阻塞性肺疾病大鼠膈肌细胞增殖与凋亡的影响

宋璟，孙志佳

（广州中医药大学，广东广州510405）

摘要：【目的】观察培土生金法（加味陈夏六君子汤）对慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠膈肌细胞增殖与凋亡的影响。【方法】将40只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、中药高剂量组（71.82 g·kg-1·d-1）、中药低剂量组（17.96 g·kg-1·d-1），采用气管内注入脂多糖（LPS）联合香烟烟熏法造模，观察各组大鼠一般情况及体质量变化；苏木素—伊红（HE）染色镜下观察大鼠膈肌病理变化，免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原（PCNA）在膈肌中的表达，并计算增殖指数（PI）。TUNEL法检测膈肌细胞凋亡情况，并计算凋亡指数（AI）及PI/AI值。【结果】与空白组比较，模型组大鼠体质量增长缓慢（P＜0.01），膈肌细胞凋亡指数显著升高（P＜0.01），PI/AI值显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，中药高剂量组大鼠体质量增长迅速（P＜0.01），细胞凋亡指数显著降低（P＜0.01），PI/AI值显著升高（P＜0.01）。【结论】培土生金法治疗COPD的作用与其能维持细胞增殖/凋亡平衡，减少COPD大鼠膈肌细胞凋亡有关。

关键词：培土生金；陈夏六君子汤；慢性阻塞性肺疾病/中药疗法；膈肌/病理学；细胞凋亡；疾病模型，动物；大鼠

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以气流受限不完全可逆为特征的疾病，是老年常见病、多发病，主要表现为慢性咳嗽、咳痰、喘息胸闷等症状，同时也是一种全身性疾病。COPD患者由于肺结构的破坏，呼吸负荷加重，长期或反复处于肺气肿，缺氧，酸中毒，炎症刺激，营养障碍等状态，导致呼吸肌营养不良、功能减退，甚至出现萎缩。膈肌作为呼吸肌的重要组成部分，容易出现膈肌疲劳，直接影响着患者的呼吸运动、气体交换等功能，参与到COPD发展为呼吸衰竭的过程。膈肌疲劳是导致呼吸衰竭的重要病机之一［1］。培土生金法是中医传统治法，具有补脾益肺的作用。临床观察发现培土生金法能改善COPD稳定期患者营养状态，减轻慢性缺氧和二氧化碳潴留，缓解膈肌疲劳，延缓肺功能进行性下降，提高生活质量［2-5］。为进一步证实培土生金法对COPD膈肌的影响，本研究从膈肌细胞增殖和凋亡角度探讨培土生金法改善COPD膈肌疲劳的作用机制，现报道如下。

1　材料与方法

1.1药物本研究采用培土生金法代表方六君子汤加减，具体方药：法半夏10 g、陈皮5 g、党参30 g、白术15 g、茯苓15 g、甘草6 g、紫苏子15 g、紫苏叶15 g、五爪龙30 g、毛冬青20 g、百合10 g。药物来自于广州中医药大学第一附属医院。

1.2动物SPF级Wistar大鼠，体质量约200 g/只，共40只，雌雄各半，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2013-0034，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2013-0092，合格证编号：44005800000260。

1.3主要试剂与仪器脂多糖（LPS，美国Sigma公司）；椰树香烟（广东中烟工业有限公司生产，焦油量11 mg/支）；TUNEL原位凋亡检测试剂盒（瑞士Roche公司）；增殖细胞核抗原（PCNA）一抗、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；二抗（美国Bioworld公司）。YD-129智能生物组织脱水机、YD-6L石蜡包埋冷冻机、YD-AB石蜡切片机、YD-315摊片烤片机（金华益迪医疗设备有限公司）；FBX50FF电子显微镜（日本Olympus公司）。

1.4分组及COPD大鼠模型的复制［6］造模期共42 d，根据大鼠性别、体质量随机分为4组，即空白组、COPD模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组10只大鼠，雌雄各半。COPD模型组、中药高剂量组、中药低剂量组分别于第1天、第14天大鼠气管内注入脂多糖溶液，具体方法：用50 mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠于固定板，暴露声门；灌胃针快速插入气管，注射生理盐水稀释后（1 mg/mL）的LPS 200 μL，然后将大鼠用固定板直立旋转，使LPS液能够均匀分布于两肺。在第2～42天（第14天除外）将造模大鼠置于100 cm×50 cm×50 cm自制染毒箱内被动熏香烟，1次/d，0.5 h/次。

1.5给药中药组均于造模第2天开始灌胃中药，中药高剂量组、中药低剂量组分别按成人临床用药的4倍、1倍换算，给药剂量分别为71.82、17.96 g·kg-1·d-1，每日1次。空白组和模型组灌胃生理盐水。灌胃时间与造模相隔至少4 h。

1.6观察大鼠一般情况观察大鼠的精神状况、活动度、饮食量、排泄物、毛发光泽度、口鼻分泌物、气喘等情况。

1.7取材腹主动脉放血处死大鼠，剖取膈肌，经40 g/L多聚甲醛固定后，梯度酒精脱水，石蜡包埋。

1.8苏木素—伊红（HE）染色膈肌组织蜡块4 μm连续切片、编号，常规脱蜡至水经HE染色、脱水、透明、封片后，镜下观察膈肌组织结构特点和改变。

1.9免疫组织化学法检测膈肌PCNA的表达4 μm膈肌组织石蜡切片常规脱蜡至水，灭活内源性氧化物酶，抗原热修复，按步骤加入一抗、二抗，DAB避光显色，苏木素复染，中性树胶封片。细胞核内出现棕色或棕褐色颗粒为PCNA表达阳性。显微镜下随机选取多个视野，计数细胞中的PCNA阳性细胞数，计算膈肌细胞增殖率（PI）：pPI= n增殖细胞数/ n细胞总数×100%。

1.10末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法（TUNEL）检测膈肌细胞凋亡4 μm膈肌石蜡切片常规脱蜡至水，体积分数3%H2O2浸泡，蛋白酶K 37℃消化，滴加TUNEL混合液，DAB+H2O2显色，苏木素复染，水洗蓝化，封片。正常膈肌细胞核被苏木素染成蓝紫色，TUNEL阳性染色定位于细胞核内，凋亡阳性细胞核被染为棕黄色。显微镜下随机选取多个视野，计数凋亡细胞数，计算膈肌细胞凋亡率（AI）：pAI= n凋亡细胞数/ n细胞总数×100%。

1.11统计方法实验数据采用SPSS 16.0进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐选用LSD检验，方差不齐采用Tamhane’s T2进行检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠一般情况整个造模期空白组大鼠反应机敏，活泼好动，毛色光泽，呼吸平稳，饮食量无改变。COPD组大鼠初期造模过程中出现惊吓乱窜，咳嗽，中后期造模过程中和不吸烟情况下均出现闭目懒动，反应迟缓，咳嗽较频，毛色灰黄无光泽，时有洗脸样动作，饮食量减少。

2.2各组膈肌病理结构改变图1结果显示：空白组膈肌纤维排列紧密、整齐、完整，无明显损伤；COPD模型组及中药组均出现不同程度的膈肌纤维排列紊乱、间隙增宽。其中中药高剂量组上述表现较轻微，模型组与中药低剂量组表现更为明显，并出现部分膈肌纤维断裂、溶解，膈肌损伤较为严重。

图1　各组大鼠膈肌组织病理变化比较（HE染色，×200）Figure 1 Pathological features of rat diaphragm of various groups（by HE，×200）

2.3各组对COPD大鼠体质量的影响表1结果显示：造模前各组大鼠体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；造模后，模型组体质量显著低于空白组，中药高剂量可显著升高大鼠体质量，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

2.4各组对COPD大鼠膈肌细胞凋亡的影响图2、表2结果显示：膈肌组织中，凋亡细胞细胞核呈棕黄色，正常细胞细胞核呈蓝紫色。模型组膈肌细胞AI较空白组显著升高，中药高剂量组可显著降低AI值，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表1　各组对COPD大鼠体质量的影响Table 1 Comparison of rat body weight in various groups　（±s，m/g）

表1　各组对COPD大鼠体质量的影响Table 1 Comparison of rat body weight in various groups　（±s，m/g）

①P＜0.01，与空白组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别空白组COPD模型组中药高剂量组中药低剂量组N 10 10 10 10造模前210.23±8.56 207.93±9.01 209.86±7.53 210.36±9.68造模后429.17±20.19 335.02±20.73①378.24±24.30②345.98±20.82

图2　各组大鼠膈肌细胞凋亡结果比较（TUNEL检测，×200）Figure 2 Apoptosis of diaphragm muscle cells of various groups（by TUNEL，×200）

2.5各组对COPD大鼠膈肌细胞增殖的影响表3结果显示：与空白组比较，模型组膈肌细胞增殖指数增多（P＜0.05），但中药高、低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。膈肌细胞增殖指数/凋亡指数（PI/AI）数据统计显示：与空白组比较，中药高剂量组基本上保持膈肌细胞增殖与凋亡过程的平衡，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，中药高剂量组PI/AI值显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。中药低剂量组PI/AI与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明模型组和中药低剂量组COPD发病过程中，虽然有膈肌细胞增殖，但以膈肌细胞凋亡占主导地位。

表2　各组对COPD大鼠膈肌细胞凋亡指数的影响Table 2　Comparison of AI of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

表2　各组对COPD大鼠膈肌细胞凋亡指数的影响Table 2　Comparison of AI of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

①P＜0.01，与空白组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别空白组模型组中药高剂量组中药低剂量组N 10 10 10 10 pAI/% 12.41±4.16 49.71±10.43①29.48±6.83②45.79±6.69

表3　各组对COPD大鼠膈肌细胞增殖的影响Table 3 Comparison of proliferation of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

表3　各组对COPD大鼠膈肌细胞增殖的影响Table 3 Comparison of proliferation of rat diaphragm muscle cells in various groups　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白组比较；③P＜0.01，与模型组比较

组别空白组模型组中药高剂量组中药低剂量组N pPI/AI10 10 10 10 pPI/% 13.21±3.74 22.67±6.87①25.89±4.91 21.75±5.97 1.09±0.25 0.45±0.11②0.89±0.12③0.49±0.17

3　讨论

呼吸衰竭作为COPD常见并发症与膈肌疲劳关系密切。膈肌疲劳作为COPD发展过程中的重要环节，直接影响COPD的预后及转归［7］。有学者认为膈肌疲劳伴随着膈肌纤维形态学改变，与膈肌细胞增殖/凋亡平衡失调、肌纤维蛋白降解/合成失衡、氧化/抗氧化系统失衡有关［8］。本研究结果显示：COPD大鼠体质量增长缓慢，膈肌细胞同时存在增殖和凋亡，但增殖与凋亡比例失衡，以细胞凋亡为主要过程，提示膈肌细胞过度凋亡参与COPD的病理过程。COPD引起膈肌细胞凋亡的确切机制尚不清楚，推测可能与以下因素有关：①吸烟可产生大量氧自由基，氧自由基及其衍生物与细胞凋亡密切相关，其通过脂质过氧化物激活多种细胞凋亡途径引起细胞凋亡；②感染是COPD加重机制之一，炎症反应产生炎症介质、细胞因子等聚集膈肌，直接导致膈肌细胞损伤，或通过调控凋亡基因的表达间接开启凋亡途径促进细胞凋亡；③COPD多伴随食欲减退、营养障碍、微量元素比例失调，最终影响膈肌结构和功能异常。确切机制有待进一步研究。

PCNA名为增殖细胞核抗原，在细胞周期S期中显著表达，参与DNA的合成，与细胞增殖密切相关。PCNA作为细胞增殖情况的评价指标，可反映细胞增殖及修复能力［9］。本研究结果显示：COPD模型组大鼠不仅存在膈肌细胞凋亡，同时发生大量膈肌细胞的增殖，而正常动物仅存在少量细胞凋亡和增殖。推断活跃的细胞增殖可反映剧烈细胞凋亡损伤后的修复能力。正常生理过程中，有损伤就会有修复，增殖与凋亡比例保持动态平衡，从而维护正常的新陈代谢，保持器官功能的完整协调。一旦细胞凋亡增加的比例高于细胞增殖，细胞凋亡占主导地位，则导致机体组织损伤发生，修复无力，产生各种病理状态。PI/AI能够反映细胞增殖与凋亡的比例是否平衡［10］。本研究结果显示：COPD大鼠膈肌细胞增殖与凋亡平衡失调，导致以膈肌细胞凋亡为主要过程的病理改变，而高剂量培土生金方能通过调节膈肌细胞增殖与凋亡平衡，减缓膈肌细胞凋亡过程，防止膈肌疲劳的过早或反复发生，增强COPD呼吸功能，改善呼吸衰竭。低剂量培土生金方则对此调节过程无影响。

中医学将COPD膈肌疲劳归属于“喘证”、“虚喘”、“喘脱”等范畴，多由久咳、久喘不愈而发。肺属金、脾属土，土生金，脾肺特殊的五行母子关系和生理病理上的相互作用决定了COPD培土生金法的治疗原则。一方面，《医碥》有云：“饮食入胃，脾胃运行其精美之气，虽曰周布四脏，实先上输于肺，肺气受其益，是为脾土生肺金，肺受脾之义，则气愈旺，化水下降，泽及百体”。故脾旺则肺气充盛，肺主气功能正常，宣降和谐，咳喘无源。另一方面，脾主肌肉，为气血生化之源，人体营养物质的产生和吸收靠脾胃对水谷精微的化生和输布，膈肌也有赖于脾胃化生水谷精微得以丰硕，从而有力调控呼吸运动，改善呼吸困难，减缓呼吸衰竭的发生。基于以上中医理论，培土生金法能改善COPD咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状，延缓膈肌疲劳的发生。本研究结果表明：高剂量培土生金方能加快COPD大鼠体质量增长速度，改善其营养状况，通过调节膈肌细胞增殖与凋亡比例，维持细胞增殖/凋亡平衡，加强膈肌损伤后修复过程，明显降低COPD大鼠膈肌细胞的凋亡。

参考文献：

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［2］宫静，陈宁，赫小梅，等.培土生金方对慢性阻塞性肺疾病稳定期患者营养状态和免疫功能的影响［J］.中国中西医结合杂志，2015，35，（5）：534.

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［9］Morris G F，Mathews M B.Regulation of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle［J］.J Biol Chem，1989，264（23）：13856.

［10］曹国强，钱桂生，林莉，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织细胞凋亡和增殖的变化［J］.中华结核和呼吸杂志，2005，28 （3）：169.

【责任编辑：黄玲】

Effect of Therapy of Supplementing Spleen to Strengthen Lung on Proliferation and Apoptosis of Diaphragmatic Muscle Cells in Rats with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

SONG Jing，SUN Zhijia
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Abstract：Objective To observe the effect of therapy of supplementing spleen to strengthen lung on the proliferation and apoptosis of the diaphragmatic muscle cells in rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）.Methods Forty Wistar rats were randomly divided into blank group，model group，high-dose Chinese medicine group（modified Chen Xia Liujunzi Decoction at 71.82 g·kg-1·d-1）and low-dose Chinese medicine group（modified Chen Xia Liujunzi Decoction at 17.96 g·kg-1·d-1）.The rat model of COPD was established by intratracheal instillation of lipopolysaccharide（LPS）combined with exposure to cigarette smoking.The general health status and the body weight of rats were observed.Pathologic changes of diaphragm tissues were observed after hematoxylin-eosin（HE）staining.Immunohistochemistry was used to determine proliferating cell nuclear antigen（PCNA）expression in diaphragm tissues，and then we calculated the cellular proliferation index（PI）.Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling method（TUNEL）was used to examine the apoptosis of diaphragmatic muscle cells，and then we calculated the apoptotic index（AI）as well as the ratio of PI/AI.Results Compared with the blank group，the body weight of the model group was significantly decreased（P＜0.01），the AI was significantly increased（P＜0.01），and PI/AI was significantly lowered（P＜0.01）.Compared with the model group，the body weight of high-dose Chinese medicine group was increased significantly（P＜0.01），AI was significantly lowered（P＜0.01），and PI/AI was significantly enhanced （P＜0.01）.Conclusion The therapeutic mechanism of therapy of supplementing spleen to strengthen lung for COPD is probably related to keeping the balance between apoptosis and proliferation of diaphragm muscle cells and to the reduction of the apoptosis of diaphragm muscle cells.

Keywords：supplementing spleen to strengthen lung；Chen Xia Liujunzi Decoction；chronic obstructive pulmonary disease/TCD therapy；diaphragm/pathology；apoptosis；disease model，animal；rats

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1007-3213（2016）03 - 0342 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．015

收稿日期：2015-12-03

作者简介：宋璟（1986-），女，博士研究生；E-mail：lovecindy314@163.com

通讯作者：孙志佳（1965-），男，教授，主任医师；E-mail：13710848770@163.com

基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（编号：2006CB504600）