腭胚突发育过程中survivin蛋白的差异性表达及意义

柯昌能，方景玲，李维珊，邹松云

深圳市龙华新区中心医院烧伤整形科，广东 深圳 518100

·基础研究·

腭胚突发育过程中survivin蛋白的差异性表达及意义

柯昌能，方景玲，李维珊，邹松云

深圳市龙华新区中心医院烧伤整形科，广东 深圳 518100

目的 探讨腭胚突发育过程中survivin蛋白的表达。方法 取孕第13.5天、14.5天、15.5天近交系C57BL/6 J鼠胚；免疫组织化学和Western blot 检测survivin蛋白的表达。结果 survivin蛋白主要表达于腭胚突周皮细胞；孕第13.5天的表达强度明显高于孕第14.5天、15.5天。结论 survivin的表达在腭胚的发育过程中存在差异性；这种差异性可能对维持腭胚的生长和融合起重要作用。

Survivin；腭；发育；胚胎

腭胚的发育大致分为三个阶段：两侧上颌生长弓处腭原基的诱导生成并沿舌侧边缘垂直向下生长；两侧腭板相对上抬致水平位置并向中线靠拢；两侧腭板的黏附、腭中脊上皮的形成和消失[1]。此过程涉及组织细胞的迁移、生长、分化、凋亡以及细胞外基质分子的合成和信号通路分子等的协同作用。上述环节受到干扰，将导致腭裂的发生。研究发现，survivin在细胞的分裂、迁移、生存中起重要作用,与胚胎早期的正常发育有关。本文研究鼠腭胚的不同发育阶段survivin的表达情况，探讨其在腭胚正常发育中的作用。

1 材 料 和 方 法

1.1 标本的获取

1.1.1 实验动物饲养、观察 8周龄近交系C57BL/6 J小鼠饲养于SPF级动物房, 雌雄比例1∶1 配对，晚6时至次日6时合笼, 次晨检查雌鼠, 有阴道粘液栓者为交配阳性,, 定此日胎龄为0.5天(E0.5)。

1.1.2 标本取材 取妊娠第13.5(E13.5)、14.5(E14.5)、15.5(E15.5)天母鼠，以颈椎脱位方式处死, 剖腹取出胎鼠。部分胎鼠放入4 %的多聚甲醛液中，4℃过夜固定，备作石蜡切片。部分胎鼠在解剖显微镜下取出腭胚突，放液氮罐中冻成备用。

1.2 试 剂

survivin蛋白抗体(兔抗鼠，Sigma公司)、全蛋白提取试剂盒(Sigma公司)、β-actin抗体(Sigma公司)、SP试剂盒及DAB显色试剂盒(武汉博士德生物技术公司)。

1.3 免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡,后按说明书操作；光镜下细胞呈棕色为阳性。

1.4 Western blot 检测按常规操作，包括提取总蛋白、电泳、转印、杂交、洗膜、染色。survivin抗体1:200稀释和β-actin抗体1:1000稀释。凝胶图像分析系统扫描分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。

1.5 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件，两组间比较用检验，多组间比较方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Survivin 在腭胚组织中的免疫组织化学染色

鼠胚13.5天，两侧腭胚突组织沿舌侧垂直生长；survivin主要表达于腭胚突周皮层细胞的胞浆，间充质细胞无表达。鼠胚14.5天，两侧腭胚突组织上抬，黏附；中间形成上皮嵴，腭突未融合；腭胚突周皮层细胞和中间上皮嵴细胞survivin表达减弱；鼠胚15.5天，两侧腭胚突组织融合，中间上皮带消失，腭胚周皮层细胞survivin少许表达(图1)。图1. 小鼠胚胎13.5，14.5，15.5天腭突上皮survivin的表达(p 腭突，t 舌)

2.2 腭胚组织中survivin蛋白Western blot 检测Western blot 检测发现，鼠胚13.5、14.5、15.5天，腭胚突组织survivin蛋白表达的灰度比值分别为（0.85±0.12）、（0.42±0.24）、（0.34±15）；15鼠胚E13.5腭突组织survivin蛋白表达的明显强于E14.5及E15.5（15.5P＜0.01）0.01

3 讨 论

Survivin 是一种凋亡抑制蛋白家,主要表达于肿瘤组织、造血干细胞、胚胎发育组织、分泌期子宫内膜等组织；大多数人类终末分化成熟的成体组织少有表达。它与细胞分裂、增殖等功能密切相关。正常情况下，survivin在维持人类早期胚胎及胸腺的发育中起重要作用[2][2]。

腭胚的正常发育涉及两个重要环节：两侧腭胚的正常生长及融合；该过程与细胞的增殖、迁移、凋亡有关；某一环节发生障碍，将导致腭裂的发生[3][3]。本研究发现，腭胚发育的早期，survivin主要表达于腭胚周皮层细胞，强度较高；可能与survivin维持vin腭胚早期生长，抑制周皮层细胞的凋亡有关。在几个基因敲除的动物模型中发现，腭裂的发生与腭胚同口腔组织黏连，限制腭胚突的上抬有关；其发生机理涉及腭胚周皮层细胞的过多、过早凋亡[4,5][4,5]。Survivinvivin维持胚胎的正常发育与其抑制细胞凋亡、促进细胞分裂有关；IRF6等基因敲除动物所发生的腭裂模型是否与survivin的表达下调，导致细胞凋亡、极性改变，促进腭胚同口腔组织的不正常融合有关，有待进一步深入研究。

本研究还发现，随着腭胚的发育，survivin的表达下降。在胚胎14.5天，两侧腭胚接触，形成中间上皮嵴；免疫组织化学检测发现上皮嵴细胞survivinvivin的表达明显下降。中间上皮嵴的消失是腭胚正常发育的关键一环。许多研究发现，细胞凋亡在腭胚中间上皮嵴消失中起重要作用；抑制细胞凋亡，将导致腭裂的融合障碍[6,7][6,7]。因此，腭胚的发育后期，survivinvivin的表达下降，有利于抑制上皮嵴细胞的增殖，促进凋亡，引导腭胚的融合。

总之，survivin的表达在腭胚的发育过程中存在差异性；这种差异性可能对维持腭胚的生长和融合起重要作用；survivin在腭胚发育过程中的差异性表达可能受相关基因调控，具体研究有待进一步深入。

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广东省医学科学技术研究基金：WSTJJ2012122420205197207095717】

柯昌能，男，1972，博士，副主任医师。