滇重楼内生真菌的分离及其抗菌活性分析

施 蕊，夏 菁，王 娟，叶 敏，赵一鹤，李 彪，4＊

（1.西南林业大学，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明650224；2.云南省林业科学院云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南昆明650201；3.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明650201；4.云南宏绿辣素有限公司，云南昆明650500）

滇重楼内生真菌的分离及其抗菌活性分析

施 蕊1，夏 菁1，王 娟2，叶 敏3，赵一鹤1，李 彪3，4＊

（1.西南林业大学，云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南昆明650224；2.云南省林业科学院云南省森林植物培育与开发利用重点实验室，云南昆明650201；3.云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，云南昆明650201；4.云南宏绿辣素有限公司，云南昆明650500）

为了解滇重楼内生菌的多样性及其抗菌能力，采用切块法分离内生菌，采用形态学观察法初步鉴定内生真菌，采用对峙试验法分析内生菌的抗菌活性。结果表明：从滇重楼植物中分离到98株内生真菌，经微生物学形态观察，初步鉴定归属于4个目，6个科和12个属。分别是根霉属（Rhizopus）、镰孢菌属（Fusarium）、丝核菌属（Rhizoctonia）、束丝菌属（Ozonium）、组丝核菌属（Sclerotium）、青霉属（Penicillium）、头孢霉属（Cephalosporium）、梳霉属（Kickxella）、筒孢霉属（Cylindrium）、刚毛孢属（Pleiochaete）、小单头孢霉属（Acremoniella）及孔球孢属（Gilmaniella）。对植物土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有抑菌效果的共有8株，其中PPC－78和PPC－43对供试病原菌的抑菌效果最强，PPC－43对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌菌丝生长的抑菌率分别为88.76%、93.67%和82.31%，而PPC－78的抑制率分别是93.55%、100.00%和95.88%。

滇重楼；内生真菌；抑菌活性

内生真菌是指生活在植物组织内部而不引起植物组织明显症状的真菌［1－2］。植物内生菌作为植物微生态系统中天然组成成分，能促进寄主植物适应环境，加强系统生态平衡。内生真菌能分泌毒素或抗生物质；内生真菌在分类单位上与病原菌接近，可作为生物防治中有潜力的生物农药开发［3］。植物内生菌一方面能维持植物微生态系统的稳态；另一方面能占据植物组织内微生态位，抵御外来菌的入侵。

滇重楼〔Paris polyphylla Smith var.yunnansensis（Franch.）Hand〕分布于云南、贵州和四川，生长在海拔1 400～3 100m的常绿阔叶林、云南松林、竹林、灌丛或草坡，根茎入药，有清热解毒、消肿止痛及凉肝定惊之功效，用于疔肿痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛及惊风抽搐等症［4］。滇重楼在我国有悠久的药用历史，随着新药的研究开发，重楼成为著名中成药云南白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片和抗病毒颗粒等产品的主要原料，制药工业的需求量逐年递增［5－6］。由于滇重楼种子有二次休眠现象［7］，种苗繁育存在巨大困难。因此，目前滇重楼的繁殖方法主要是根茎切块繁殖和组织培养等，但在育苗过程中创口和组培苗易受到病原菌侵染，导致重楼根腐病大面积发生，造成严重的经济损失。为解决这一问题，笔者通过分离维持滇重楼微生态稳定的内生真菌，并筛选具有抗真菌活性的菌株，以期筛选能够抵御外来病菌的内生菌，为滇重楼的幼苗繁育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 滇重楼块茎 滇重楼块茎于2014年采自于云南省普洱市镇沅县中草药种植基地百草园。

1.1.2 培养基 试验培养基为PDA培养基。

1.1.3 供试病原菌 供试病原菌由云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室提供，供病原菌株编号及其病原菌名称见表1，采用的病原菌均为植物土传病害病菌。

1.2 滇重楼内生菌分离及鉴定

取健康重楼植株的根状茎，弃泥土，用水冲洗干净，晾干水分，按照以下步骤进行表面杀菌处理：0.2%升汞消毒10～30s，无菌水冲洗，75%酒精消毒10～60s，无菌水冲洗。在无菌条件下将重楼样品切成2cm×2cm的小块，种植于PDA培养基内，培养5～10d，观察培养基中有菌落形成后挑取菌落转接入PDA斜面培养基中，按常规微生物学方法分离、纯化和保藏。分离得到的菌株分别用PPC－01、PPC－02、PPC－03……按顺序编号。

表1 供试病原菌的编号及名称Table 1 Names and number of pathogenic fungi

采用真菌学插片培养方法，对分离获得的内生真菌进行显微形态观察，进行分类鉴定［8－9］。

1.3 抑菌性测定

滇重楼内生真菌的抑菌活性测定采用平皿对峙培养法，各供试病原菌和滇重楼内生真菌置28℃黑暗条件下培养3d后，用打孔器（直径6mm）沿其菌落边缘打菌饼，将内生真菌与病原菌菌饼接种于PDA平板上距中心15mm处同一直线上的两点中，同时以只接病原菌和内生真菌的平板作为对照，每处理重复3次，分别置于28℃恒温培养箱中黑暗培养。每24h观察1次，并分别测量病原菌菌落指向内生真菌菌落的半径和内生真菌菌落指向病原菌菌落的半径。

1.4 抑菌率计算方法

滇重楼内生真菌对病原菌的抑菌率公式：

抑菌率＝（对照病原菌菌落半径－病原菌菌落指向内生真菌菌落的半径）／对照病原菌菌落半径× 100%

1.5 数据统计

数据采用SPSS17.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 滇重楼内生真菌的分类

从滇重楼植物中分离到98株内生真菌，经微生物学形态观察初步鉴定为4目6科12个属（表2）。其中，丛梗孢目有7个属；毛霉目仅有1个属。

表2 滇重楼内生真菌的种群结构组成Table 2 Population structure of endophytic fungi in P.polyphylla

2.2 滇重楼内生真菌对病原菌的抑菌率

由表3可见，滇重楼内生真菌PPC－78和PPC－43对供试的植物土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有很强的抑制作用，其抑菌率均在82%以上，且PPC－78对尖孢镰刀菌的抑制率达100%。内生菌PPC－25的抑菌效果较好，对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌的抑制率在58.83%～72.81%。内生真菌PPC－03、PPC－21、PPC－32、PPC－71和PPC－73对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌也有不同程度的抑菌效果。

表3 滇重楼内生真菌对病原菌的抑菌率Table 3 Antimicrobial activity of endophytic fungi in P.polyphyllaon pathogenic fungi%

3 结论与讨论

从滇重楼植物中分离到98株内生真菌，经微生物学形态观察，初步鉴定属于毛霉目、瘤痤孢目、无孢目和丛梗孢目4个目，毛霉科、瘤痤孢科、无孢菌科、丛梗孢科单孢亚科、丛梗孢科多孢亚科和暗梗孢科单孢亚科6个科，根霉属、镰孢菌属、丝核菌属、束丝菌属、组丝核菌属、青霉属、头孢霉属、梳霉属、筒孢霉属、刚毛孢属、小单头孢霉属和孔球孢属12个属。该结果与孙桂丽等［10］研究相似，其结果是从云南重楼中块茎中分离得到166株内生真菌，分别归属于毛霉目、瘤痤孢目、无孢目和丛梗孢目4个目，毛霉科、瘤痤孢科、无孢菌科、丛梗孢科单孢亚科、丛梗孢科多孢亚科和暗梗孢科单孢亚科6个科，20个属；但本研究结果与王世林等［11］的研究结果有所差异。本研究分离得到的滇重楼内生真菌的数量和归属较孙桂丽等研究少，可能原因：一方面分离的滇重楼样本差异，另一方面分离滇重楼内生菌的培养基比较单一。尽管分离得到的滇重楼内生真菌与前人的研究有所差异，但也在一定程度上反映了滇重楼内生真菌的多样性较丰富。此外，要充分研究滇重楼内生真菌多样性，需要采集不同年份和不同生境的滇重楼样本，同时采用多种培养基配方进行分离。对于滇重楼内生真菌抑菌的原理，需要进一步研究滇重楼内生真菌与病原菌的营养竞争和生态位竞争等关系，同时研究内生真菌代谢物的抑菌活性以及在不同培养条件下代谢物的活性大小。

通过对峙试验，98株滇重楼内生真菌中，对植物土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和烟草黑胫病菌有抑菌效果的共有8株，编号分别是PPC－03、PPC－21、PPC－25、PPC－32、PPC－43、PPC－71、PPC－73 和PPC－78，其中PPC－78和PPC－43对供试病原菌的抑菌效果最强，抑菌效果均在82.31%以上，且PPC－78的抑制率均在90%以上。

［1］Petrini O.Fungal endophytes of tree leaves［C］／／Andrews J H，Hirano S S.Microbial Ecology of Leaves.New York：Springer Verlag，1991：179－197.

［2］Stone J K，Bacon C W，White J F.An overview of endophytic microbes：endophytian defined［C］／／Bacon C W，White J F.Microbial Endophytea.New York：Marcel Dekker，2000：3－29.

［3］孔庆科，丁爱云.内生细菌作为生防因子的研究进展［J］.山东农业大学学报：自然科学版，2001，32（2）：256－260.

［4］卫生部药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2005：183.

［5］李 恒.重楼属植物［M］.北京：科学出版，1998.

［6］任安芝，高玉葆.植物内生真菌一类应用前景广阔的资源微生物［J］.微生物学通报，2001，28（6）：90－93.

［7］王丽萍，赵学伟.云南重楼野生驯化及栽培技术研究初探［J］.中国野生植物资源，2002，21（1）：62.

［8］巴尼特，亨 特.半知菌属图解［M］.沈崇尧，译.北京：科学出版社，1997.

［9］魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.

［10］孙桂丽，陈有为，夏国兴，等.云南重楼植物内生真菌的分离及抗菌活性筛选［J］.微生物学杂志，2005，25 （6）：59－62.

［11］王世林，周立刚，李 英，等.滇重楼寄生菌的研究［J］.微生物学报，1999，39（2）：160－163.

（责任编辑：刘忠丽）

Separation and Antimicrobial Activity of Endophytic Fungi in Paris polyphylla

SHI Rui1，XIA Jing1，WANG Juan2，YE Min3，ZHAO Yihe1，LI Biao3，4＊

（1.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Foresty Adiministration，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224；2.Key Laboratory of Conservation of Rare，Endangered and Endemic Forest Plants，State Forestry Administration，Kunming，Yunnan650204；3.Key Laboratory of the Ministry of Education for Agro－Biodiversity and Pest Management，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201；4.Yunnan Honglv Capsacin Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650500，China）

In order to research endophytic fungi diversity of P.polyphyllaand their inhibition activity.The endophytic fungi were isolated from tuber of P.polyphylla and identified by using morphological method，the inhibition activity were tested by the dural culture method.Results：98endophytic fungi were collected from tuber of P.polyphylla，through morphologic observation of microbiology，they were belonged to four orders，six family and twelve genera，which were Rhizopus，Fusarium，Rhizoctonia，Ozonium，Sclerotium，Penicillium，Cephalosporium，Kickxella，Cylindrium，Pleiochaete，Acremoniella，Gilmaniella，respectively.Eight of all endophytic fungus had antimicrobial activity on Rhizoctoniasolani，Fusariumoxysporum，Phytophtoraparasitica var.nicotianae，which were pathogenic and could infect plant via soil.The fungi marked PPC－78and PPC－43have strong inhibiting effect on tested pathogenic fungi，inhibition ratio of PPC－43on Rhizoctoniasolani，Fusariumoxysporum，Phytophtoraparasiticavar.nicotianae were 88.76%，93.67%，2.31%，and inhibition ratio of PPC－78were 93.55%，100.00%，95.88%respectively.

Paris polyphylla；endophytic fungi；antimicrobial activity

Q939.5

A

1001－3601（2016）07－0301－0069－03

2015－01－15；2016－07－02修回

国家林业公益性行业科研专项项目“高产脂思茅松良种选育及功能基因克隆与鉴定”（201304105）；云南省科技计划对外科技合作计划－国际科技合作项目“滇牡丹重要经济性状研究与综合利用技术引进”（2015IA005）；云南生物资源保护与利用国家重点实验室开放基金项目“牡丹油化妆品在天然化妆品中的应用研究”（2015）；云南省科技计划重点新产品开发项目“蒜头果新品种选育及其神经酸产品开发研究”（2015BB018）；云南省应用基础研究重点项目“竹子花青素生物合成途径及其基因调控机理研究”（2013FA054）

施 蕊（1982－），女，讲师，博士，从事民族药用植物资源的开发利用工作。E－mail：shirui0227＠163.com

＊通讯作者：李 彪（1987－），男，工程师，博士，从事生物多样性保护、生物农药研发工作。E－mail：biaobiao201＠163.com