体细胞克隆技术及其存在的问题

张德福，戴建军，吴彩凤，张树山

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所；上海市农业遗传育种重点实验室/动物遗传工程研究室，上海201106）



体细胞克隆技术及其存在的问题

张德福，戴建军，吴彩凤，张树山

（上海市农业科学院畜牧兽医研究所；上海市农业遗传育种重点实验室/动物遗传工程研究室，上海201106）

摘 要：阐述了体细胞克隆技术在生命科学和畜牧业中应用的重大价值，该技术是当今生物技术中最重要的研究领域之一，但还存在着一些问题；详细分析、讨论了目前克隆技术存在的问题。

关键词：克隆技术；生命科学；畜牧业；问题

动物克隆技术的研究和应用是当代生命科学与生物技术研究的热点之一，是衡量一个国家生命科学科研水平的重要标志。自首例体细胞克隆羊诞生以来，克隆技术以其无可比拟的优势在畜牧业生产、医药学研究、再生医学及基础生物学研究中发挥着巨大的作用，具有广阔的应用前景。

自1998年起本实验室在猪体细胞克隆技术上进行了深入研究，特别是在利用克隆技术保存地方猪种种质资源及生产转基因猪方面取得了一批研究成果［1-5］，也对克隆技术的应用前景进行了大量的介绍［6-8］；在此过程中也发现克隆技术依然存在着一些亟待解决的问题［9-13］。结合近二十年来本研究团队的相关研究结果，本文对目前克隆技术存在的问题进行分析探讨，以期为该技术的进一步健康发展提供借鉴。

1　克隆效率低

克隆技术目前存在的最大问题是克隆效率低。所谓克隆效率通常是指克隆胚胎（或称重构胚胎）经胚胎移植到受体（即代孕母体）后获得的克隆动物个体比例。有学者详细统计分析了牛、山羊、绵羊和小鼠的克隆效率，牛的克隆效率相对较高为10%—20%，山羊为3%—5%，绵羊为3%—10%，猪为0.5%—3%，小鼠为4%—5%［14］。克隆动物常常出现所谓的“三高”，即克隆胎儿流产率高、围产期死亡率高、新生动物死亡率高，是导致体细胞克隆效率低下的主要原因。HILL等［15］克隆了13头牛，4头于胎儿期流产，3头于出生时或出生后死亡；WELLS等［16］将988枚克隆胚胎移植到受体后，有133头克隆牛出生，出生1 d后死亡率高达21.8%，3月龄内死亡率为14.4%，只有63.8%的犊牛存活超过3个月。本实验室在克隆猪上的研究表明，大部分克隆猪胎儿在妊娠2个月前后发生流产［9］。

可以看出，从克隆胚胎到克隆胎儿直至克隆新生动物各个阶段的发育都不同程度地受到影响，使克隆效率十分低下，加上克隆动物的生产成本非常昂贵，使克隆技术的推广应用受到了极大的影响。

2　克隆动物胚胎、胎儿发育异常

2.1克隆动物胚胎发育异常

牛克隆胚胎移植后，在妊娠的前3个月内，胎儿死亡及流产的比例很高。与体内/体外受精胚胎相比，大量的克隆胚胎不能正常发育。早期胚胎损失发生的原因较多，如胎儿畸形或胎盘发育不正常、母体子宫或激素环境异常、胎儿-母体相互排斥等。有研究者［17］对牛体细胞克隆胚胎的发育异常进行了较为系统的研究，将牛异常后代综合症（AOS，abnormal offspring syndrome）分为4类（表1）。

表1　牛异常后代综合症分类Table 1 Category of bovine abnormal offspring syndrome

2.2克隆动物胎儿的巨胎症

当体细胞克隆胚胎的细胞核重构或重编程不完全时，就会引起基因表达的异常，从而导致胎盘和胎儿的发育异常，造成的后果通常是形成巨胎症（LOS，large offspring syndrome）［18］。在妊娠期，巨胎症的明显特征是尿囊增大、乳腺发育缺失和妊娠期延长等。在出生时，典型的特征是体重特别大、器官大小异常、丧失运动神经调节、大舌头等。巨胎症在克隆牛上最为突出，在克隆羊、克隆小鼠中也普遍存在；但在克隆猪上，迄今尚未发现有此症状。

2.3克隆动物胎儿胎盘发育异常

一般克隆胚胎有30%—50%可以发育到囊胚期，与体外受精的胚胎没有太大的差异（30%—40%）。但大部分克隆胚胎在附植后停止发育，能够发育到出生的克隆胚胎仅有1%—5%，远远低于体外受精胚胎（30%—60%）［19］。

胎盘发育异常与克隆胎儿妊娠过程中死亡密切相关。胎盘是哺乳动物胚胎发生过程中特有的器官，是母体与胎儿气体、营养及代谢废物交换的主要场所；此外胎盘也分泌一些与妊娠相关的激素、生长因子以及胎儿免疫蛋白等。克隆动物常常出现胎盘肥大现象，但可用于母体和胎儿进行物质交换的部位却有所减少，致使胎盘功能无法正常发挥。

胎盘发育异常是目前克隆动物普遍存在的问题。在克隆小鼠、牛、羊和猪中均有克隆胎儿胎盘发育异常的报道。克隆牛中，胎盘发育异常多发生在胎盘小体上。研究显示，克隆牛胎儿从30 d到90 d的发育过程中，胎盘的血管发育和胎盘子叶数目都有所减少，一些胎盘含有异常的绒毛上皮和血管化程度低的尿囊。上述胎盘发育的缺陷是导致克隆牛早期胎儿流产的重要原因［20］。也有研究显示，克隆牛胎儿胎盘的异常发育还会引起MHC的异常表达从而引起母体对克隆胎儿的排斥，大大增加流产率［21］。

3　克隆动物的发育缺陷

克隆动物死亡率较高，以克隆牛为例，有些新生克隆牛犊初期看似挺健康，但到青年或成年后出现异常。

李世杰等［22］在新生死亡的9头克隆牛中均发现器官发育异常，包括心脏肥大、右心室增大、卵圆孔闭合不全以及瓣膜发育不全等；肝发育异常主要表现为肝肿大和充血；肺发育异常主要表现为出生时肺未充起以及肺形态发育异常。徐金霞等［23］也发现1例死亡克隆牛脑和免疫器官组织异常。另外，由于免疫力和抗体水平低，也增加了克隆动物感染和发病的可能性，因此新生克隆牛易患肠炎、脐带感染和呼吸道感染。

RENARD等［24］以耳成纤维细胞为供体获得克隆牛，出生1.5个月后死于贫血，尸体解剖发现脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。本实验室［9］对新生死亡克隆猪的5种组织进行详细的组织病理学观察，结果发现：克隆猪肺脏表现为典型的肺不张，肺泡壁有明显充血；肝脏的肝细胞形态异常，肝索紊乱，无典型肝小叶结构；肾脏的肾小球处于不同发育阶段，肾小管管腔尚未形成，仅有肾小管轮廓；另外在获得的克隆猪中也发现个别公猪出现隐睾症状。

4　克隆效率低下的原因分析

在体细胞克隆中，供体核来自于高度分化的体细胞。在分化过程中，体细胞核获得了高度特异的DNA和染色质的表观遗传修饰（epigenetic modification），导致了分化状态的细胞记忆。由于供体核支持克隆胚胎的发育，因此当供体细胞核放至去核的卵母细胞后，供体核必须经过表观遗传修饰的重编程（reprogramming），激活对胚胎早期发育有重要作用的基因，并抑制与分化相关基因的表达，从而获得发育的全能性［25］。目前认为，供体核的不完全编程导致在发育过程中有重要的基因没有表达或异常表达，是克隆效率低的主要原因［26］。

为探求新生克隆猪可能的死亡原因以及是否存在不完全的DNA甲基化重编程，本实验室运用亚硫酸氢盐测序法分别检测了H19基因和IGF2R基因差异甲基化区域（DMR）在新生死亡克隆猪和同期正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的甲基化状态［27］。结果发现，H19基因DMR在克隆猪肺脏中表现为超甲基化，极显著高于正常猪（95.20%vs 46.80%，P＜0.01），且10个测序克隆中存在2处连续的全甲基化CpG位点（4—9位，12—S17位），而在其他组织中甲基化差异不显著（P＞0.05）；IGF2R基因DMR在肝脏中处于超甲基化状态，显著高于正常猪（80.00%vs 39.41%，P＜0.05），而在肺脏中为去甲基化状态，极显著低于正常猪（14.71%vs 66.47%，P＜0.01），在其他组织差异不显著（P＞0.05）。表明在死亡克隆猪中，H19基因在肺脏和IGF2R基因在肝脏与肺脏中存在不完全的DNA甲基化重编程，这可能是导致克隆动物死亡的原因之一。

为查明本课题组所获得的2头克隆猪隐睾发生的原因，采用相对荧光定量PCR技术和亚硫酸氢盐测序法分析检测了WT1、FGF9、SOX9和INSL3基因在克隆猪隐睾中的表达量及其启动子区CpG位点甲基化状态。结果表明：WT1基因异常表达、睾丸组织FGF9、INSL3基因DNA甲基化重编程异常，是导致克隆猪发生隐睾的重要因素［10-11］。进一步利用双向电泳-质谱体系的比较蛋白质组学技术进行分离和鉴定，并结合生物信息学手段对部分差异蛋白进行功能分析［28］，发现克隆巴马小型猪的心脏蛋白共有11个差异蛋白，其中5个为上调蛋白，6个为下调蛋白［12］；肺脏蛋白共有31个差异蛋白，其中23个为上调蛋白，8个为下调蛋白［13］。从而在蛋白质水平上证实：克隆巴马小型猪的心肺均存在一定程度的功能失调。

中国农业大学李宁教授课题组的相关研究也显示，克隆牛的一些功能基因DNA甲基化、组蛋白乙酰化都发生不同程度变化［29-30］。

总的来说，供体细胞核重编程的异常普遍存在于克隆胚胎和克隆动物中，是引起体细胞克隆效率低的主要原因。因此，如何提高供体细胞核的重编程是一个亟待解决的问题。

5　细胞质遗传问题

众所周知，动物的遗传信息主要储存在核DNA上，但还有微量的遗传信息包含在线粒体中。线粒体DNA经过卵母细胞胞质的分配而呈母系遗传方式。在体细胞克隆过程中，供体细胞通过融合进入受体细胞质后，在将核DNA导入卵母细胞的同时，也把供体细胞的线粒体DNA随之带入。因此克隆胚胎中存在受体和供体两种来源的线粒体DNA，这两种来源的线粒体DNA在克隆胚胎随后发育过程中的命运怎样？以及对克隆胚胎发育的潜在影响究竟如何？这些问题已引起有关研究者的注意［30］。STEINBORN等［31］在体细胞克隆牛的不同组织中发现了供体细胞和受体细胞线粒体DNA共存的现象，但二者线粒体DNA所占比例从克隆前到克隆后整个发育过程基本保持不变，供体线粒体DNA约占1%。线粒体DNA的异质性似乎并不影响克隆牛的正常发育，但线粒体DNA与核DNA之间的不协调是否是造成克隆胚胎活力低下的原因之一还有待进一步研究。

此外，在小鼠和牛的克隆研究中，还发现细胞质的遗传物质影响克隆后代的表型，如花斑、毛色等；本实验室在克隆巴马小型猪上的研究中也发现，来自同一供体细胞系的克隆同胞背部花斑不完全一致。这是由供体细胞线粒体DNA还是由卵子细胞质中的遗传物质引起的目前尚不清楚。

迄今为止，人们虽然在克隆技术的研究上积累了一些经验，使克隆效率有了一定的提高，但克隆机理的探明才是解决克隆效率的关键所在。动物克隆技术是一项系统工程，需要由分子遗传学、发育生物学、细胞学等相关基础学科提供可靠的理论指导与技术支持［32］，否则很难再进一步提高体细胞克隆效率。目前，许多新兴的研究方法如生物芯片、二维凝胶电泳和质谱技术已应用于动物克隆机理的研究之中。通过对表观遗传的分析，期望能够揭示克隆动物表观遗传的分子机制，以进一步提高克隆效率。

参 考 文 献

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（责任编辑：闫其涛）

Animal somatic cell cloning technique and its problems

ZHANG De-fu，DAI Jian-jun，WU Cai-feng，ZHANG Shu-shan
（Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanghai Academy of Agricultural Sciences；Division of Animal Genetic Engineering，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201106，China）

Abstract：Animal somatic cell cloning technique，with its great value in life science and animal husbandry，is one of the most important research fields in current bio-technology.However，there are still some problems.The paper here briefly reviewed and discussed the problems in animal cloning technique in detail.

Key words：Cloning technique；Life science；Animal husbandry；Problems

中图分类号：S814.8

文献标识码：A

文章编号：1000-3924（2016）03-168-04

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.33

收稿日期：2016-01-14

基金项目：国家自然科学基金（31372315）；国家转基因生物新品种培育科技重大专项（2014ZX08006-005、2014ZX08006）；上海市科委农业成果转化专项（123919N0700、133919N1700）

作者简介：张德福（1963—），男，博士，研究员，研究方向为动物胚胎工程。Tel：021-62200389，Fax：021-62207858，E-mail：zhangdefuzdf@ 163.com.cn