不同培养条件对绵羊卵母细胞体外成熟和凋亡的影响

陈鲁杰，梁浩勤，赖露菊，赵宏伟，魏锁成（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）



不同培养条件对绵羊卵母细胞体外成熟和凋亡的影响

陈鲁杰，梁浩勤，赖露菊，赵宏伟，魏锁成*
（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030）

摘要：目的，探讨不同温度和不同培养时间对绵羊卵母细胞体外培养，成熟和凋亡的影响，选择合适的温度和培养时间为绵羊卵母细胞进行体外成熟提供技术支持。方法：在绵羊死亡30 min之内取出卵巢4～6 h带回实验室，切割法收集卵母细胞。在5%CO2、饱和湿度等条件相同情况下，分别在36.0℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃、39℃下培养24～26 h。实验中获得的结果数据，采用t检验方法进行差异显著性分析。结果：26 h的成熟率高于其他4个时间的成熟率，在培养22 h到26 h过程中，随着培养时间的增加，卵母细胞的成熟率呈增高。但是在26 h过后，随着培养时间增加，卵母细胞的成熟率呈递减趋势，至30 h卵母细胞的成熟率明显低于22 h的成熟率。38.5℃时卵母细胞的成熟率最高，36℃是卵母细胞的凋亡率最高。卵母细胞成熟率的整体趋势是随着温度的上升呈正相关。

关键词：卵母细胞；成熟率；凋亡率；卵巢；体外培养

项目来源：西北民族大学研究生科研创新项目（编号：YCX14168）。

随着胚胎工程技术的发展，对胚胎的需求量越来越大，如体外受精、转基因、核移植、外源基因的倒入等均需要卵母细胞，而卵母细胞的成熟发育与胚胎有着紧密的联系，卵母细胞的体外成熟技术日益受到重视［1］。Pincus等（1935）首先提出了卵母细胞的体外成熟（IVM），Edwards（1965）对动物的细胞进行了体外成熟研究。我国于1985年后20世纪80年代末期才开始研究家畜卵母细胞体外成熟培养技术。

21世纪，对卵母细胞的体外成熟技术提出了更高要求，因为如果体外成熟技术不过关，体外成熟卵母细胞质量有问题，对以后哺乳动物体外受精、转基因、核移植、外源基因的导入等会造成极大的影响。所以卵母细胞体外成熟培养体系的完善成了生物学家们最重视的科学技术。对绵羊卵母细胞体外成熟培养技术研究较晚也比较迟缓，导致培养技术缺乏。因此，开发和研究绵羊的卵巢卵母细胞体外成熟培养技术，建立和完善一套完全在体外环境下快速生产和保存大量品质优良、价格低廉的卵母细胞的技术势在必行。卵母细胞体外成熟培养受很多因素的影响，如：培养的时间、温度、CO2浓度、湿度、培养基成分（如激素、生长因子等）、动物的年龄、卵巢采集的季节等。关于这些因素对卵母细胞的体外成熟的作用效果的研究不多见，虽然文献记载单一因素的报道，但是多因素综合作用的研究鲜见。

自从1878年德国科学家Scherk对家兔和豚鼠进行了体外受精的尝试以来，许多的科学家对此进行了研究［1］。过去若干年里，人们为探索早期胚胎最佳的体外培养系统做了大量工作［2］。现在已应用卵母细胞体外成熟（in vitromaturation，IVM）和体外受精技术体外生产胚胎［3］。经过研究者不断地努力已被世界各国实验室所采用，并且已在世界上进行了商业性应用（1987年在爱尔兰建立的商业性卵子公司集团Ovamass Ltd.，主要生产肉牛、羊胚胎），产生了重大的经济效益［4，5］。目前，体外受精的各个步骤：卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、卵母细胞的体外受精、受精卵的体外发育以及配子和胚胎的冷冻保存等，都可在体外进行［6］。哺乳动物早期胚胎体外培养效果已经可以为胚胎生产产业化服务，但是最适合卵母细胞体外生长发育的条件还没有完全确定［7，8］。兰州大尾羊是兰州地区的特有羊品种，然而，兰州大尾羊的数量目前只有3 000～4 000只，属濒危品种，被列入中国畜禽遗传资源目录和国家级畜禽种质资源保存目录。因此其数量远远不能满足市场需求，养殖技术较落后，没有形成规模，也还不是畜牧业养殖的支柱畜种，对当地农民致富也没有明显的带动作有，急需要改良，对其扩繁和保护已刻不容缓。通过超数排卵技术和胚胎移植技术的推广应用，可以提高繁殖能力和生产性能，提升产羔率，达到年产2胎，增加存栏量和出栏数，力争数量在5年内翻一番，加快生长发育，增加产毛量，毛皮质量明显提高，具有广阔的市场前景和显著地经济效益［9］。

卵母细胞的体外培养是胚胎移植技术的关键步骤。但是，兰州大尾羊卵母细胞体外保存的合适温度还不清楚，培养的合适温度还没确定等一系列问题，对胚胎移植技术有一定影响。本研究就是为了解决此类问题。对兰州大尾羊卵母细胞的体外培养进行进一步研究，为兰州大尾羊胚胎移植技术中的卵母细胞体外培养提供理论基础。

1　不同温度对绵羊卵母细胞体外成熟的作用

1.1材料

1.1.1实验材料2～3岁成年绵羊卵巢，采自兰州市小西湖马忠华定点屠宰场。

1.1.2实验试剂与药品NaCl，KCl，CaCl·2H2O，KH2PO4，MgCl2·2H2O，Na2HPO4·12H2O，NaHCO3，丙酮酸钠，葡萄糖，青霉素，链霉素，M199，LH（促黄体素，规格：4μg×10支），FSH（促卵泡素，规格：100单位×10支），E2（雌二醇，规格：4 mg×10支）三种激素均为宁波市三生药业有限公司产品，发情羊血清。

1.1.3主要仪器设备体视显微镜（LEICA DMIL产自北京悦昌行科技有限公司）；倒置显微镜（LEICA S8APO产自北京悦昌行科技有限公司）；超净工作台（产自苏州智净净化设备有限公司）；CO2培养箱（STIK，型号IL- 161CT产自施都凯仪器设备（上海）有限公司）；电子天天平（FA2004N产自上海精密科学仪器有限公司）；恒温水浴锅（上海精宏实验设备限公司）；高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；一次性培养皿（35 mm×10 mm）；吸胚针；注射器及手术刀等。

1.1.4培养液的配制双抗（P/S）制备：青霉素160万单位，加上80 ml的超纯水，变成青霉素2万单位/ml；链霉素100万单位，加上50 ml的超纯水，变成链霉素2万单位/ml；青霉素和链霉素各取50 ml，再用超纯水稀释100倍，使得培养基中每毫升青霉素链霉素100个单位。

PBS液：NaCl 800 mg/100 ml，KCl 20 mg/100ml，CaCl2取13 mg/100ml，MgCl2取10 mg/100 ml，磷酸氢二钠289.8 mg/ml，丙酮酸钠3.6 mg/100 ml，C6H1206取5.56 mmol/L，定容至100 ml的超纯水中，用一次性过滤器过滤除菌后，放置4℃冰箱内保存，以待备用。

M199基础液：M199 0.22 g，NaHCO30.95 g，三蒸水定容100 ml。用0.4 μm的过滤器过滤除菌，4℃保存。

洗卵液（捡卵液）：M199基础液99 ml，丙酮酸钠0.22 μg/ml，1%双抗。用0.4 μm的过滤器过滤除菌，4℃保存。

发情羊血清（ESS）的制备：从甘肃省临夏市和政县泰祥三谷产业园采回发情羊血清，血样必须在于4℃冰箱内放置1～2h后，再用离心机用2 500 r/min的转速离心20 min，取其中的血清。将分离好的血清在56℃条件下，灭活30 min，最后进行过滤分装。

成熟液：M199基础液8 ml，LH（促黄体素）50 μg，FSH（促卵泡素）5 μg，E2（雌二醇）10（取1 ml用三蒸水稀释20倍，取1 ml），发情羊血清1 ml，双抗0.1 ml。用0.4 μm的过滤器过滤除菌，4℃保存。

1.2方法

1.2.1绵羊卵巢的采集在绵羊宰杀30 min之内取出卵巢，放入事先准备好的装有35～37℃的含有0.9%的青、链霉素的生理盐水的保温瓶中，4～6 h内带回实验室进行实验。卵巢置于含青、链霉素的35～37℃生理盐水的培养皿中，用灭菌的37℃的生理盐水冲洗卵巢2～3遍，剔除卵巢表面及周围的脂肪、结缔组织和系膜。一只手持镊子固定卵巢，另一手拿眼科剪将卵巢表面的卵泡剪破，使卵泡液流出。较小的卵泡则将其所在卵巢表面剪碎，但不完全剪碎卵巢，尽可能地减少组织块。最后再用PBS液冲洗剪碎的卵巢表面，使附着在上面的卵母细胞流入PBS液中。然后静置1～2 min后在体视显微镜下用吸胚针进行捡卵。

1.2.2卵母细胞的收集卵巢经过处理后用切割法收集卵母细胞。在倒置显微镜下用吸胚针挑出卵丘细胞层完整、包裹致密，卵母细胞胞质颜色均匀的卵丘——卵母细胞复合体（cumulus- oocyte- complexes，COCs）用于体外成熟培养。COCs在洗卵液中清洗3～4遍。最后，从洗卵液中把COCs移至预平衡2～4h的微滴中培养。

1.2.3卵母细胞的分级标准将不同采集方法收集到的卵泡液置于体视显微镜下进行观察，收集卵母细胞，并对收集到的卵母细胞进行分级评价。根据包被卵母细胞的卵丘细胞完整性、卵丘细胞层数以及卵母细胞的胞质均匀性将卵母细胞分为4级：A级，卵丘细胞三层以上，胞质均匀；B级，1～2层卵丘细胞，胞质均匀；C级，裸卵或卵丘细胞不完整；D级是死亡退化的卵母细胞。A/B级卵母细胞为可用的卵母细胞。

1.2.4绵羊卵母细胞体外成熟培养本实验采用微滴培养方法：取一35 mm培养皿，先在培养皿中用成熟培养液做成80 μl的微滴，每个培养皿均匀分布4～5滴；然后加入1 ml灭菌石蜡油均匀覆盖住微滴，在培养箱中平衡2h以上。COCs洗净后穿破石蜡油放入微滴中，每微滴培养卵母细胞15～30枚左右，数量过多或过少均会影响卵母细胞的体外成熟。

在38.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。培养一定时间后，用透明质酸将COCs经移液枪反复吹打分离卵母细胞及卵丘细胞，并用PBS清洗2～3遍收集卵母细胞，看第一极体排出的情况。卵母细胞成熟的一个重要指标就是卵丘细胞的扩散，将卵母细胞成熟后的卵丘细胞扩散程度分为4级（图1）。

图1　电镜下的卵母细胞a：1级；b：2级；c：3级（10×10）.

1.2.5实验设计实验一为在5%CO2浓度与饱和湿度等条件相同情况下，分别在36.0℃、37.0℃、37.5℃、38.0℃、38.5℃、39℃下培养24～26 h。

实验二是在5%CO2浓度与培养温度（38.5℃）相同条件下，培养22 h、24 h、26 h、28 h和30 h。

最后放在透明质酸酶中反复吹打去除颗粒细胞，并用PBS液清洗2～3遍收集卵母细胞，统计第一极体的排出情况。

1.2.6成熟卵母细胞的判定卵细胞的成熟包括核成熟和胞浆成熟。第一极体的排出是卵母细胞体外培养成熟的标志，也是细胞核成熟的标志，胞质成熟的是以卵丘细胞扩散为标志。

细胞核成熟的判定方法：卵母细胞成熟培养20～24 h后，挑选卵丘层扩散良好的COCs，放在含有0.3% BSA（Sigma）的HEPES- TALP液中，旋涡振荡5 min，彻底去除卵丘细胞，在体视镜下观察第一极体排出情况。取部分卵放到四角滴有石蜡油：凡士林（1∶9）的载玻片上，加盖玻片，在显微镜下边观察边逐渐轻轻向下压，直到卵胞质充满卵腔为止。放入无水乙醇：冰乙酸（3∶1）固定液中固定24 h以上，再用1%的醋酸地衣红（45%醋酸配制）染色1～2 min，倒置显微镜下观察卵母细胞核形态。

图2　成熟前后不同时期的绵羊卵母细胞A.绵羊未成熟卵母细胞（×100），周围有3～4层颗粒细胞包裹，同时有一薄层完整的透明带形成；B.绵羊成熟卵母细胞（×100），完成第二次减数分裂，颗粒细胞层明显膨大，以卵母细胞为中心呈放射状向四周扩散；C.排出第一极体的绵羊卵母细胞（×200），透明带明显增厚，细胞核被挤到一边，第一极体排出。

1.2.7结果统计实验中获得的结果数据，采用t检验方法进行差异显著性分析。

1.3实验结果

表1　培养条件绵羊卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞培养不同时间后的成熟率见表1和图2。26 h的成熟率高于其他4个时间的成熟率，在培养22 h 到26 h过程中，随着培养时间的增加，卵母细胞的成熟率呈增高。但是在26 h过后，随着培养时间增加，卵母细胞的成熟率呈递减趋势，至30 h卵母细胞的成熟率明显低于22 h的成熟率。

图3　培养温度与卵母细胞成熟率和凋亡率

根据表1和图2均显示培养温度越高，细胞成熟率越高。经过许多研究证明，产生这种情况的原因主要是由于细胞内活性物质的活性决定的。在动物正常的生理温度范围内，卵母细胞的代谢强度与温度成正比，温度升高，酶、激素等活性物质的活性也随之升高，细胞代谢也增强，成熟率就会升高。但是温度过高或过低均会影响卵母细胞的生长和成熟。当温度过高到达一定限度时会导致酶、激素等的失活，同时会破坏细胞膜的结构，导致渗透性改变，甚至引起细胞死亡［10］。当温度略低于正常温度时，对卵母细胞没有重大影响，但是会引起细胞内活性物质的活性降低，细胞代谢减弱，导致卵母细胞的生长发育受到抑制，所以产生了36～37.5℃的成熟率较低的情况。实验结果显示绵羊在39.0℃时成熟率最高，可能是细胞内的各种酶和激素等物质的活性最强，细胞代谢旺盛，所以成熟率最高。经过查证大量资料显示在培养温度高于绵羊正常体温时，由于破坏了细胞结构，细胞成熟率会降低。所以反证本实验培养温度越高，细胞成熟率越高；39.0℃在绵羊正常体温范围（38.3～39.9℃）内成熟率最高，符合以前的研究成果。

适宜的培养温度是哺乳动物卵母细胞体外成熟培养成功的一项重要因素，然而不同的哺乳动物卵母细胞培养的最适温度也不相同。经Lenz（1983）研究显示牛卵母细胞对温度的敏感性很强，Wang通过组合实验证明在38～39℃是牛的卵母细胞体外成熟的最适温度。Eng（1986）指出猪的卵母细胞在39℃下体外培养成熟率比在37℃下高。戴荣亮等人也证实了体外培养温度在山羊正常体温（38.5～39.7℃）范围内变动，对卵母细胞成熟率无显著影响［11］。本实验证实，只要在绵羊正常体温范围（38.3～39.9℃）内变动，则对成熟率无显著影响，符合以前的研究成果。虽然在实际生产活动中的培养环境远远不如实验室严密和完备，但是只要控制在绵羊的正常生理温度范围内，卵母细胞的成熟率是可以保证。

2　讨论

2.1不同温度对绵羊卵母细胞的体外成熟影响

适宜的培养温度是成功进行卵母细胞体外成熟培养的重要因素，然而不同的哺乳动物卵母细胞培养的最适温度也不相同。在这项研究中，卵母细胞的成熟率，随着培养温度从36.0℃升至38.5℃，逐渐增加。最大的成熟率和最小细胞凋亡率在38.5℃时出现。许多研究证明，产生这种情况的原因主要是由于细胞内活性物质的活性决定的。在动物正常的生理温度范围内，卵母细胞的代谢强度与温度成正比，温度升高，酶、激素等活性物质的活性也随之升高，细胞代谢也增强，成熟率就会升高。但是温度过高或过低均会影响卵母细胞的生长和成熟。当温度过高到达一定限度时会导致酶、激素等的失活，同时会破坏细胞膜的结构，导致渗透性改变，甚至引起细胞死亡［10］。有实验结果显示绵羊在39.0℃时成熟率最高。戴荣亮等证实生理体温（38.5～39.7℃）范围内变动对山羊卵母细胞体外成熟率无显著影响［12］。绵羊母细胞体外成熟率在正常体温范围（38.3～39.9℃）也无明显差异［10］。Eng等研究发现，39℃时猪卵母细胞的成熟率为71.0%，37℃时为35%。刘灵39℃时培养山羊卵母细胞，获得79.4%的成熟率。张涌等在38.5℃的条件下培养山羊卵母细胞，成熟率为68.4%［12］。

2.2培养时间对卵母细胞体外成熟培养的影响

徐燕霞等（2014）报道培养20 h的卵母细胞的成熟率为57.8%，培养22 h的成熟率为63.6%，培养24 h 为64.4%，培养26h为72.5%，培养20 h和22 h的成熟率差异显著；培养20 h和24 h、26 h的成熟率差异极显著；培养22 h和24 h成熟率差异不显著；培养24 h和26 h差异极显著。随着培养时间的延长，卵母细胞的成熟率在提高，但是时间太长，卵母细胞就会老化，不利于卵母细胞的体外受精。王超（2007）和杨志杰等（2008）的研究结果显示培养24 h、26 h的卵母细胞成熟率显著高于18 h和20 h的。吕丽华等（2009）研究了山羊培养24 h、27 h、30 h后卵母细胞的成熟率，结果显示培养27 h卵母细胞成熟率显著高于其他2组。不同物种卵母细胞成熟时间不同，牛卵母细胞需要24 h就成熟，但是猪卵母细胞的成熟需要培养42～48 h。卵母细胞体外培养时间对卵母细胞的成熟及其之后的体外受精和早期胚胎的发育非常重要，卵母细胞培养时间太短不易成熟，但是时间太长容易造成卵母细胞透明带硬化，从而不适合受精。因此卵母细胞的成熟培养时间对卵母细胞的成熟和体外受精非常重要，具有深远的意义。本试验结果说明，绵羊的卵母细胞培养22～24 h成熟率高且利于体外受精。

3　结论

试验结果表明，用切卵法收集卵母细胞之后，在5%CO2，培养26 h，饱和湿度的条件下培养温度38.5℃时绵羊卵母细胞的成熟率最高、凋亡率最低。在5% CO2，培养温度38.5℃，饱和湿度的条件下培养26 h时绵羊卵母细胞的成熟率是37.3%最高，凋亡率是25.4%最低。

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（编辑：高真贞）

中图分类号：S814.4

文献标识码：B

文章编号：1006- 799X（2016）05- 0076- 05

作者简介：陈鲁杰（1986-），男，河南商水人，在读硕士研究生，主要从事动物医学生殖技术研究。

通讯作者：魏锁成（1962-），男，甘肃甘谷人，教授，主要从事动物生殖生物技术的教学和科研工作。