乌鳢产吲哚金黄杆菌的鉴定及其胞外产物特性分析

王鑫毅 韩艳楠 金 珊 王 丽 赵青松 陈寅儿（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

研究简报

乌鳢产吲哚金黄杆菌的鉴定及其胞外产物特性分析

王鑫毅 韩艳楠 金 珊 王 丽 赵青松 陈寅儿
（宁波大学海洋学院，宁波 315211）

乌鳢（Channa argus）俗称乌鱼、黑鱼、火头等，因其骨刺少，肉味鲜美，且具有去瘀生薪、生肌补血、滋补调养等多种生理功能，一直广受国内外消费者的亲睐。近十多年来，为顺应国内外贸易市场的需要，我国人工养殖乌鳢迅速发展。但由于高密度养殖、种质退化、环境恶化及人为因素干扰等多种原因，使得养殖乌鳢病害日趋增多，新的病原也不断出现。2013年5—6月，在浙江宁波部分乌鳢养殖池塘出现了批量死亡事件，病鱼主要症状为体表鳞片大面积脱落，有的烂眼、烂鳃、腹部膨胀、皮肤变黄并伴有少量体表出血现象； 解剖发现其肝脏颜色变黄，有淡色斑点，组织糊化，偶有腹水。作者对典型症状的病鱼进行了取样、病原分离和初步鉴定，认为引起本次乌鳢疾病的病原为金黄杆菌属（Chryseobacterium sp.）细菌。据资料显示［1—3］，金黄杆菌（Chryseobacterium sp.）是一类革兰氏阴性菌，其广泛存在于土壤、水、植物等自然环境及医院环境，为条件致病菌，是人感染性疾病的重要病原，也可引起畜禽［4］和鱼类［5］、蛙类［6—9］、中华鳖［10］、河蟹［11］等多种水产动物严重疾病。目前国内外关于金黄杆菌病的研究资料很少，已有的报道大多是针对病症的描述、医院临床感染分布及耐药性分析等。为了尽快明确乌鳢金黄杆菌病的病原及致病机理，作者采用常规生理生化试验结合16S rRNA序列分析等方法对所分离的病原菌进行了鉴定，并对病原菌的胞外产物成分及致病性进行了研究，以期为鱼类金黄杆菌病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼来源

病鱼取自浙江宁波某乌鳢养殖池塘，共3批次，每次至少解剖3尾病鱼，体重350—500 g； 健康鱼购自宁波水产市场，体重350—400 g，外观检查并经抽样解剖检验确认无病。

1.2 病原菌的分离培养

取发病症状典型的乌鳢，无菌解剖取病鱼血液、肝、肾等组织分别划线接种于TSA平板上，28℃恒温培养48h后，挑取形态特征一致的5株优势菌进行纯培养，转接斜面保存备用。

1.3 病原菌形态观察及生理生化试验

取1.2纯培养的细菌转接TSA斜面，经28℃培养20h，用生理盐水制成约108cell/mL的菌悬液后作革兰氏染色及电镜（日立H-7650）观察。电镜样品采用醋酸铀染色10s。生理生化试验参考伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）［12］和赵乃盺等资料［1，2］进行。

1.4 16S rRNA基因扩增及其序列分析

以分离菌基因组DNA为模板，用细菌通用引物27f和1492r进行16S rRNA序列的PCR 扩增［13］。PCR反应条件为:94℃预变性3min； 94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，30个循环； 最后72℃温育6min。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶回收，连接到pMD18-T载体上，作TA克隆，转化至大肠杆菌DH5α，由上海英俊生物技术有限公司完成测序。

将所测的菌株的16S rRNA基因序列上传至Genbank数据库，并通过数据库中的BLAST进行序列相似性比较，选取与所测序列同源性高的已知菌株，采用ClustalX软件进行多序列比对（Multiple Alignments），利用MEGA5.05软件，采用邻位相连（Neighbor-joining method）构建系统发育树，通过自举分析（Bootstrap）进行置信度检测，自举数集1000次。

1.5 人工感染试验

根据1.3和1.4实验结果，所分离的5株菌相似度在99%以上，应为同一种菌，因此，人工感染实验仅采用WL20130525菌株进行。实验在120 cm×80 cm×50 cm的塑料桶中进行，每桶放养体重350—400 g的健康乌鳢10尾，连续充气，暂养2d后进行感染试验。WL20130525菌株培养24h后，用无菌生理盐水制成浓度约2.68×108、2.68×107、2.68×106、2.68×105、2.68×104cfu/mL的菌悬液，细菌量根据M cF浊度管结合活菌计数方法确定。感染组共10组，每个菌浓度肌肉注射20尾，每尾注射0.3 mL，对照组10尾注射同量无菌生理盐水。用SPSS软件计算细菌半致死浓度［14］。

1.6 WL20130525菌胞外产物的制备及活性测定

细菌胞外产物的制备采用玻璃纸提取法［15］，考马斯亮蓝法测定胞外产物蛋白浓度。胞外产物活性采用杯碟法测定［16］，在TSA培养基上进行。溶血试验血琼脂平板分别采用脱纤维绵羊血、脱纤维兔血、乌鳢血、鲫鱼血，pH 7.5。

1.7 WL20130525菌胞外产物的致病性试验

试验设5个实验组和1个对照组，分别在120 cm× 80 cm×50 cm的塑料桶中进行。每桶放养体重350—400 g健康乌鳢10尾，连续充气，暂养2d后进行试验。取1.6中制备的胞外产物，用PBS稀释成70、104、156、235、352 μg/mL系列浓度，每个浓度肌肉注射 10尾，每尾注射0.3 mL，对照组注射等量无菌PBS。胞外产物的注射量根据预实验确定。用改良寇氏法计算胞外产物半致死浓度［17］。

1.8 WL20130525菌的药敏试验

以涂布法接种0.1 mL WL20130525菌于TSA平板上，贴上药敏纸片，28℃恒温培养24h后，测抑菌圈直径。所用药敏纸片购于杭州滨和微生物试剂有限公司。

2 结果

本实验从患病乌鳢体内共分离5株病原菌，经形态观察、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析，所分离的5株菌相似度在99%以上，应为同一种菌，因此，本实验结果仅针对WL20130525菌株。

2.1 病原菌的致病性

采用从患病乌鳢中分离到的病原菌WL20130525感染健康乌鳢，感染初期乌鳢躁动不安，狂游，有跃出水面的现象； 随着感染时间的延长，鱼活力明显下降，精神萎顿，感染第2天鱼开始出现死亡，体表注射部位明显红肿，感染3d后注射部位出现一块圆形病灶，该处鳞片向外张开，松动易脱落，鳞下体表充血肿胀； 随着病情加重，鱼鳞大片脱落，皮肤或成黄色，注射部位溃烂； 解剖发现腹腔内组织松软糜烂，肝肾略有肿大，肠组织黏连。5个感染菌浓度168h的死亡率分别为100%、90%、75%、40%、10%，WL20130525菌对乌 鳢的LD50为4.63×105cfu/mL。感染鱼症状与自然发病鱼相似，从感染发病鱼体内的血液、肝、肾等组织中又可以分离到与WL20130525菌株形态特征完全一致的菌株，说明WL20130525菌株确为乌鳢的致病菌。

2.2 WL20130525菌株形态及生理生化特征

革兰氏染色和电镜观察显示，WL20130525菌株为革兰氏阴性杆菌，菌体两端钝圆，大小约为（0.3—0.5）µm×（1.0—2.3）µm，大多单个散在，无鞭毛，不能运动，无荚膜和芽孢（图 1）在TSA平板上培养24h，菌落为黄色，圆形，直径约1—2 mm，表面隆起、光滑，边缘整齐且有光泽。生理生化特征见表 1，经查阅相关资料［1，2，13］，可知WL20130525菌株为产吲哚金黄杆菌（Chryseobacteriumindologenes）。

表 1 WL20130525菌的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of WL20130525

2.3 16S rRNA基因序列及系统发育分析

利用引物27F和1492R扩增菌株的16S rRNA基因，共包括1549个碱基。在GenBank中的注册号为JX515610。将测定的16S rRNA基因序列与GenBank中的参考序列进行比对，找出相关序列，利用生物学聚类软件MEGA5.05进行系统发育树的构建（图 2）。从N-J法构建的系统发育树上可以看出菌株WL20130525属于金黄杆菌（Chryseobacterium）家族，与该菌序列最接近的两个菌株产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）和黏金黄杆菌（C.gleum），其相似度分别为98.3%和97.8%。综合2.2和2.3结果，作者认为WL20130525菌株应为产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）。

2.4 WL20130525菌胞外产物的活性和致病性

采用玻璃纸提取法制备WL20130525菌胞外产物，考马斯亮蓝法测得蛋白浓度为704 μg/mL。以杯碟法测定WL20130525菌胞外产物的酶活性，结果显示，用50 μL的胞外产物提取液所产生的各酶透明圈直径分别为卵磷脂酶31 mm，蛋白酶20 mm，淀粉酶13 mm，脂肪酶8 mm，说明酶活性卵磷脂酶>蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶。WL20130525菌胞外产物对乌鳢血呈完全（β）溶血，对绵羊血和鲫鱼血部分溶血，对兔血不溶血。注射WL20130525胞外产物后，乌鳢发病症状与感染菌病鱼症状相似，5个实验组168h的死亡率分别为100%、60%、40%、20%、0，胞外产物对乌鳢的LD50为158.49 μg/kg体质量，说明WL20130525胞外产物具有较强毒性。

2.5 WL20130525菌药敏试验结果

从表 2可知，WL20130525菌对米诺环素、利福平、恩诺沙星、头孢西丁、强力霉素、依诺沙星、诺氟沙星等7种药物较敏感，对链霉素等10种药物耐药。

3 讨论

本实验从患病乌鳢（C.argus）体内分离到菌株WL20130525，经人工感染试验证实，WL20130525可使乌鳢的生活状态、体表和肝肾等主要组织器官出现明显的病症，且在人工感染患病鱼的体内又可分离到与WL20130525完全一致的菌株，说明WL20130525具有强致病性。通过对WL20130525的16S rRNA基因分析，发现它与产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）的亲缘性最接近，且相似度为98.3%； 形态学观察及生理生化特征试验进一步确定WL20130525菌株为产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）。

图 2 菌株WL20130525及其相关菌株16S rRNA基因邻位连接法系统发育树

表 2 WL20130525菌的药敏试验结果Tab.2 Drug sensitive test results of WL20130525

1994年Vandamme等根据菌体形态和生理生化特性提出将黄杆菌属（Flavobacterium）中的部分菌统一划归新建立的金黄杆菌属（Chryseobacterium）［18］，主要有大比目鱼金黄杆菌（C.balustinum）、黏金黄杆菌（C.gleum）、产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）、脑膜脓毒性金黄杆菌（C.meningosepticum）、吲哚金黄杆菌（C.indoltheticum）、大菱鲆金黄杆菌（C.scophthalmum）等6个种，这一归属和命名得到了普遍认可。后来赵乃盺等根据Vandamme的分类及金黄杆菌属的特征，在原有6个种的基础上增加了污水金黄杆菌（C.defluvii）、台湾金黄杆菌（C.formosense）、宙斯特氏金黄杆菌（C.joostei）、C.daecheongense、C.Miricola等共11个种［1］。

自1992年首次发现豹蛙产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）感染性疾病，其后西班牙、日本、中国等多个国家和地区陆续有报道产吲哚金黄杆菌引起人类疾病［19，20］。据资料显示，产吲哚金黄杆菌是医院感染的主要病原菌之一，可引起人肺炎、败血症、脓毒血症、局部组织伤口感染等严重疾病，由于其耐药范围广、临床症状与体征复杂，因此死亡率高，近几年已引起国内外医学界的广泛重视［3，19］。目前关于产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）感染动物的报道不多，已有的资料大多也是针对病症的描述，如Olson等［2 1］报道了该菌引起豹蛙败血症，Callon等［22］报道了该菌感染奶羊，祖国掌等［11］报道该菌可引起河蟹疾病，Kampfer等［23，24］报道了该菌可引起大西洋鲑鱼疾病，Ilardi［25］等报道了该菌感染了大马哈鱼。而至今还未见国内有关产吲哚金黄杆菌对养殖鱼类感染致病的报道。由于产吲哚金黄杆菌（C.indologenes）是人和动物的共患病原，它不仅对人类健康严重危害，而且对养殖动物也产生潜在威胁，因此，值得进一步的关注和深入研究。

目前关于产吲哚金黄杆菌致病机理的研究很少，已有的研究显示可能与其胞外蛋白有关［18］。本实验结果也显示，WL20130525菌胞外产物具有强致病性，而其胞外产物中蛋白酶活性较强。此外，已有的研究也表明，产吲哚金黄杆菌具有多重耐药性，其耐药机制复杂，除细菌外膜通透性屏障外，还存在多种超广谱β-内酰胺酶及金属β-内酰胺酶，可导致碳青霉烯类、头孢菌素类、氨基糖甙类等抗生素广泛耐药［3，26］。本实验结果显示，WL20130525菌对米诺环素、利福平、头孢西丁、强力霉素、恩诺沙星、依诺沙星、诺氟沙星等7种化学疗剂高度敏感，但由于农业部第2292号公告已把恩诺沙星、依诺沙星、诺氟沙星等列入禁用渔药，2016年12月31日起禁止使用，因此可考虑把米诺环素、利福平、头孢西丁、强力霉素等4种作为治疗乌鳢金黄杆菌病的首选药物。由于产吲哚金黄杆菌广泛存在于空气、水、土壤等自然环境中，为条件致病菌，且化学药物大量的使用不仅会滋生大量的耐药菌株，而且污染环境，甚至危害人类食品安全，因此，该病的控制一定要以防为主，特别是在初夏和初秋季节是该病的高发期。

参 考 文 献：

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IDENTIFICATION AND ANALYSIS ON EXTRACELLULAR PRODUCTS CHARACTERISTICS OF CHRYSEOBACTERIUM INDOLOGENES ISOLATION FROM CHANNA ARGUS

WANG Xin-Yi，HAN Yan-Nan，JIN Shan，WANG Li，ZHAO Qing-Song and CHEN Yin-Er
（School of Marine Sciences in Ningbo University，Ningbo 315211，China）

关键词：乌鳢； 产吲哚金黄杆菌； 生理生化鉴定； 16S rRNA； 胞外产物； 抗菌药物

Key words:Channa argus； Chryseobacterium indologenes； Physiological and biochemical identification；16S rRNA； Extracellular products； Antimicrobial agents

doi:10.7541/2016.86

收稿日期：2015-09-15；

修订日期：2015-12-16

基金项目：海洋公益性行业专项经费资助项目（201105007）； 宁波大学水产浙江省重中之重一级学科开放基金（xkzsc1503）资助［Supported by the Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean（No.201105007）； Ningbo University Aquaculture in Zhejiang Province Priority Level 1 Subject Open Fund（No.xkzsc1503）］

作者简介：王鑫毅（1995—），男，浙江嘉兴人； 本科； 研究方向为水产动物病害防控。E-mail:578405056@qq.com

通信作者：金珊（1964—），教授； E-mail:jinshan@nbu.edu.cn

中图分类号：S941.42

文献标识码：A

文章编号：1000-3207（2016）03-0641-06