木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表达

李志永　李　玲　李丽玮　侯建明　甄艳君

(保定市徐水区人民医院病理科，河北　保定　072550)

木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡及LOX-1、NOX4mRNA的表达

李志永李玲1李丽玮2侯建明3甄艳君3

(保定市徐水区人民医院病理科，河北保定072550)

〔摘要〕目的探讨木贼有效部位对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC-ECV304)凋亡抑制作用的可能机制。方法体外ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤，用木贼有效部位进行干预。采用流式细胞术检测细胞凋亡率；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮细胞血凝素样ox-LDL受体1(LOX-1)mRNA、NADPH氧化酶4(NOX4)mRNA及 Caspase-3 mRNA表达。结果与模型组比较木贼有效部位干预后细胞凋亡率明显下降(P<0.05)，LOX-1 mRNA、NOX4mRNA及 Caspase-3 mRNA表达明显下调(P<0.01)。结论木贼有效部位可能通过抑制LOX-1 mRNA及 NOX4 mRNA的表达，实现对凋亡相关基因的调控来减少内皮细胞的凋亡。

〔关键词〕木贼；有效部位；氧化低密度脂蛋白；内皮细胞；凋亡；血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1；NADPH氧化酶

动脉粥样硬化(AS)起始于血管内皮细胞损伤〔1〕。而内皮细胞过度凋亡则是血管内皮损伤的一种重要形式，被认为是AS的始动步骤〔2〕。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作为主要凋亡诱导因素之一，在AS的发病中起了关键作用。血凝素样ox-LDL受体1(LOX-1)是新近发现的内皮细胞膜上的ox-LDL特异性受体，介导ox-LDL对内皮细胞的病理学作用，NADPH氧化酶(NOX)是内皮细胞产生活性氧的主要酶体，研究证实LOX-1与NADPH氧化酶在介导内皮细胞的损伤及凋亡过程中起重要作用，两者均与AS的发生发展密切相关〔3,4〕。课题组在离体及在体实验均证实中草药木贼提取物具有抑制内皮细胞(EC)凋亡和调控凋亡相关基因表达等多层面机制保护内皮细胞的作用，并初步判定木贼有效药理活性部位为黄酮及芬酸类化合物〔5,6〕。但其抗内皮细胞凋亡的具体途径仍不清楚，本实验旨在通过观察木贼有效部位干预ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡和对内皮细胞LOX-1 mRNA及NOX4 mRNA表达的影响，进一步探讨木贼有效部位抗凋亡的作用机制。

1材料与方法

1.1材料CO2恒温培养箱(美国Revco)，756MC型紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，Gen Amp5700型PCR仪(美国PE公司)，FR-200A凝胶扫描系统(上海复日科技有限公司)，微量移液器(美国Eppendorf)，Epics-XLⅡ型流式细胞仪(美国B-C公司)，木贼饮片(购于石家庄市乐仁堂大药房,经河北医科大学中医学院中药系鉴定)，槲皮素和阿魏酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号0080-9705，0773-9910)，D101型大孔树脂(天津大均科技开发有限公司)，HUVEC-ECV304(武汉大学中国动植物保存中心)，新生小牛血清(四季青公司)，DMEM培养液及胰酶(GIBCO公司)，总RNA提取试剂(TRIzol)、cDNA第一链合成试剂盒、PCR试剂盒及DNA Marker(均为北京TIANGEN公司)，PCR引物(北京三博远志生物公司)，其他试剂均为国产分析纯。

1.2木贼有效部位的制备称取适量木贼饮片置于圆底烧瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2 h，电热套加热回流提取3次，每次2 h，过滤并合并滤液，得木贼提取液。称取大孔树脂40 g，将提取液上树脂柱，先以水冲至洗脱液近无色后(Molish反应阴性)分别用蒸馏水，30%乙醇，70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液作为测试样品，分别以槲皮素和阿魏酸为对照品用紫外分光光度计检测此样品中总黄酮和总酚酸含量并测定其纯度。将70%乙醇洗脱液减压浓缩后，用无血清培养基DMEM将样品稀释，以二甲基亚砜(DMSO)使其充分溶解，此为用于本实验的木贼有效部位。

1.3ox-LDL的制备采用沉淀法参照文献〔7〕制备。

1.4细胞培养与分组采用15%新生小牛血清DMEM作为培养液,在37℃、5%CO2培养箱中瓶养HUVEC-ECV304。取对数生长期细胞15瓶，将细胞培养液换成无血清DMEM培养液，培养6 h后随机分成3组①对照组：无血清DMEM培养液；②模型组：无血清DMEM培养液培养1 h后加入ox-LDL，使其终浓度为80 μg/ml；③木贼有效部位组(有效部位组)：无血清DMEM培养液中加入木贼有效部位，使其终浓度为50 μg/ml，培养1 h后加入ox-LDL，使其终浓度为80 μg/ml。继续培养12 h后收集细胞和培养液进行检测。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率用胰酶消化收获细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次，1 500 r/min离心5 min弃上清，细胞用70%冷乙醇固定，置于-20℃保存待测。碘化丙啶(PI)染色后，流式细胞仪检测内皮细胞凋亡率。

1.6RT-PCR按Trizol试剂盒说明书提取各组细胞总mRNA，经2%琼脂糖凝胶电泳后，每一样品均出现清晰的28 S和18 S条带,且28 S条带的亮度和宽度约为18 S条带的2倍，纯度鉴定A260/A280值为1.8～2.0。RNA的反转录过程及扩增过程分别按试剂盒说明书进行。LOX-1引物序列为：上游5′-TGGGAAAAGAGCCAAGAGAA-3′，下游5′-TGCAGCCAGCTAAATGACAG-3′,扩增产物全长229 bp；NOX4引物序列为：上游5′-CTCAGCGGAATCAATCAGCTGTG-3′，下游5′-AGAGGAACACGACAATCAGCCTTA-3′，扩增产物全长286 bp；Caspase-3引物序列为：上游5′-ATACTCCTTCCATCAAATAG-3′，下游5′-AACATCACAAAACCATAATC-3′，扩增产物全长411 bp；内参GAPDH引物序列为：上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，扩增产物全长300 bp。LOX-1反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，51.8℃退火40 s，72℃延伸50 s；NOX4反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s；Caspase-3反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，47℃退火60 s，72℃延伸60 s；GAPDH反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s；以上均30个循环后再72℃延伸5 min。取10 μl反应产物在2%琼脂糖凝胶(含EB)上电泳，FR-980生物电泳图像分析软件分析灰度值，以目的条带与内参照GAPDH条带的灰度比值代表目的基因mRNA的表达水平。

1.7统计学处理采用SPSS15.0软件行单因素方差分析，S-N-Kq检验。

2结果

2.1细胞凋亡率流式细胞仪分析结果显示：模型组细胞凋亡率较对照组显著升高(P<0.05)。加入木贼有效部位后细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。见表1。

2.2LOX-1、NOX4及Caspase-3 mRNA表达与对照组比较模型组LOX-1 mRNA、NOX4 mRNA及Caspase-3 mRNA的表达均明显升高(P<0.01)；与模型组相比有效部位组LOX-1 mRNA、NOX4 mRNA及Caspase-3 mRNA的表达均显著降低(P<0.01)。见表1及图1。

表1　木贼有效部位对内皮细胞凋亡率及LOX-1、NOX4及

与对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

1～3:对照组；模型组；有效部位组图1　各组细胞LOX-1、NOX4及Caspase-3 mRNA RT-PCR产物的电泳图

3讨论

木贼中含有黄酮类及芬酸类化合物〔8〕，这两类物质具有抗炎、抗氧化，保护血管内皮细胞，抑制AS形成的作用。本课题组在前期动物实验基础上将木贼有效部位提取的方法加以改进得到含黄酮及芬酸质量分数较高的提取物，经离体实验得到与动物实验类似的结果，证实黄酮及芬酸是木贼抗AS的有效部位之一。

LOX-1是ox-LDL特异性受体，主要存在于内皮细胞膜表面，在介导内皮细胞对ox-LDL结合、内吞、降解，及内皮细胞凋亡和功能障碍等过程中起关键作用〔3〕。LOX-1在ox-LDL诱导内皮细胞凋亡中表达上调并介导内皮细胞凋亡，抗LOX-1抗体则抑制内皮细胞的凋亡〔9〕。本实验表明木贼有效部位可能是通过下调LOX-1 mRNA的表达实现抑制内皮细胞凋亡的。NOX是一种过氧化物酶，其催化产物活性氧参与机体防御和信号传导等许多生理过程。内皮细胞主要表达NOX4。NOX在内皮细胞凋亡中起了重要作用，它可能通过调节细胞内活性氧的产生而参与细胞凋亡〔9,10〕。研究表明〔11〕ox-LDL与LOX-1结合后，可激活细胞膜上的NOX，导致活性氧表达增加。抑制LOX-1能显著降低内皮细胞中活性氧的生成及凋亡的发生〔9〕。本实验显示木贼有效部位可下调ox-LDL诱导的内皮细胞LOX-1 mRNA的表达，推测木贼有效部位应使NOX4 mRNA的表达下降，本实验结果也证实加入木贼有效部位后NOX4 mRNA表达受到明显抑制，表明NOX4 mRNA表达的下降是受LOX-1介导的，这显示木贼有效部位抗内皮细胞凋亡与抑制LOX-1-NOX4途径密切相关。

Chen等〔12〕报道ox-LDL通过LOX-1下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，激活Caspase-3诱导内皮细胞凋亡。最近有研究〔13〕发现ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的可能途径为：LOX-1通过激活NOX使活性氧产生增加，后者使p38MAPK磷酸化并激活核转录因子NF-κB，而NF-κB可调控Caspase-3及 Bcl-2基因的表达促进内皮细胞的凋亡。Caspase家族是多种途径发生凋亡的关键酶，而Caspase-3是凋亡发生的中心环节，本研究中ox-LDL诱导的内皮细胞Caspase-3 mRNA表达升高，木贼有效部位能减少Caspase-3 mRNA表达。研究曾证实木贼有效部位可使ox-LDL诱导的血管内皮细胞Bcl-2 mRNA表达升高，Bax/Bcl-2比值明显降低〔6〕。故推测木贼有效部位可能是通过抑制LOX-1及NOX4来达到调控凋亡相关基因表达的。

综上所述，木贼有效部位抑制内皮细胞凋亡途径之一可能是通过下调LOX-1表达来抑制NOX4激活，进而通过调控Caspase-3 mRNA表达减少内皮细胞的凋亡。

4参考文献

1Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the 1990s〔J〕.Nature,1993;362(6423):801-9.

2王书乐,张志斌.血管内皮细胞凋亡研究进展〔J〕.辽宁中医药大学学报,2011;13(3):50-3.

3郭良才,徐新,张社兵.血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1与动脉粥样硬化相关进展〔J〕.中国心血管杂志,2012;17(2):155-7.

4权媛,钱民章.NADPH氧化酶与动脉粥样硬化〔J〕.心脏杂志,2010;22(5):767-9.

5甄艳军,安杰,侯建明,等.木贼对动脉粥样硬化早期大鼠内皮细胞凋亡及Bax、Bcl-2表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2003;23(5):304-5.

6李志永,王旭辉,李奕,等.木贼有效部位提取物对氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡相关基因的调控〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(19):4186-8.

7姜远英,曾华武.改良沉淀法快速分离制备人血清低密度脂蛋白〔J〕.第二军医大学学报,1997;18(4):389-91.

8李淑惠,靳丹虹.木贼科植物研究概况Ⅰ.化学成分研究〔J〕.中草药,2000;31(7):附12-4.

9Chen XP,Xun KL,Wu Q,etal.Oxidized low density lipoprotein receptor-1 mediates oxidized low density lipoprotein-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells:role of reactive oxygen species〔J〕.Vasc Pharmacol,2007;47(1):1-9.

10Dong F,Zhang X,Li SY,etal.Possible involvement of NADPH oxidase and JNK in homocysteine-induced oxidative stress and apoptosis in human umbilical vein endothelial cells〔J〕.Cardiovasc Toxicol,2005;5(1):9-20.

11Lu J,Mitra S,Wang X,etal.Oxidative stress and lectin-like ox-LDL-receptor LOX-1 in atherogenesis and tumorigenesis〔J〕.Antioxid Redox Signal,2011;15(8):2301-3.

12Chen J,Mehta JL,Haider N,etal.Role of caspases in ox-LDL-induced apoptotic cascade in human coronary artery endothelial cells〔J〕.Circ Res,2004;94(3):370-6.

13Bao MH,Zhang YW,Zhou HH.Paeonol suppresses oxidized low-density lipoprotein induced endothelial cell apoptosis via activation of LOX-1/p38MAPK/NF-κB pathway〔J〕.J Ethnopharmacol,2013;146(2):543-51.

〔2014-12-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者：甄艳君(1952-)，女，教授，硕士生导师，主要从事中药防治动脉粥样硬化的基础研究。

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2343-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.013

1保定市徐水区人民医院皮肤科2邢台市人民医院检验二科

3河北医科大学基础课教学部

第一作者：李志永(1974-)，男，主治医师，硕士，主要从事中药防治动脉粥样硬化的基础研究。