肝X受体通过线粒体通路调控高糖诱导的H9C2细胞凋亡

王云开　陶　剑　李卫勇　王迎春　殷　然

(南昌大学第一附属医院心血管内科　江西省高血压研究所，江西　南昌　330006)

肝X受体通过线粒体通路调控高糖诱导的H9C2细胞凋亡

王云开陶剑李卫勇1王迎春殷然

(南昌大学第一附属医院心血管内科江西省高血压研究所，江西南昌330006)

〔摘要〕目的探讨高糖环境中肝X受体通过线粒体途径在调控H9C2细胞凋亡过程中的作用。方法以H9C2细胞为研究对象，分为低糖组(Control组)、甘露醇组、高糖组、高糖+T0901317组及高糖+5CPPSS-50组。检测各组H9C2细胞的活性，细胞内活性氧水平，Bax 、Bcl-2 mRNA，cleaved caspase-3蛋白的表达及细胞凋亡率，并观察细胞线粒体膜电位变化。结果表达LXRs组明显降低高糖诱导的Bax mRNA、激活型caspase3蛋白表达和细胞内活性氧水平；上调高糖抑制的Bcl-2 mRNA表达和线粒体膜电位。结论LXRs激动剂T0901317可改善高糖环境中H9C2细胞活性，抑制细胞凋亡，对细胞起到一定的保护作用；抑制LXRs后，对高糖环境中H9C2细胞损伤作用更明显。LXRs可通过线粒体途径调控高糖环境所致H9C2细胞凋亡。

〔关键词〕高糖；肝X受体；凋亡；线粒体通路

糖尿病时线粒体活性氧簇(ROS)〔1〕产生增多可导致线粒体膜通透性增加，膜电位下降。线粒体中包含着许多重要的与细胞凋亡直接相关的蛋白酶或蛋白质，包括细胞色素C、半胱氨酸蛋白酶(caspase-2)，3，9、Bcl-2家族、AIF等。当线粒体膜通透性增加时，这些凋亡相关因子从线粒体释放到胞质中增多，从而加速细胞凋亡的发生。肝X受体(LXRs)是一类属于核受体超家族依赖配体激活的核转录因子，在能量代谢、炎症、凋亡及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RASS)中起着关键的调节作用〔2〕。研究发现，通过激活LXRs可抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、核转录因子(NF)-κB等信号通路调控相关凋亡基因的表达。研究激活LXRs能否抑制高糖环境中心肌细胞的凋亡，且这种效应是否是通过线粒体途径来完成对寻找防治糖尿病心肌病心肌细胞凋亡有重要的意义。本实验通过应用LXRS激动剂T0901317及抑制剂5CPPSS-50处理高糖培养的H9C2细胞，测定细胞内ROS水平、线粒体膜电位变化及线粒体途径中相关凋亡基因的表达，探讨LXRs调控高糖诱导的H9C2细胞凋亡与线粒体途径的关系，为糖尿病心肌病的防治提供新的靶向及理论基础。

1材料和方法

1.1材料H9C2细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；低糖DMEM培养基、高糖DMEM培养基、新生胎牛血清购自美国Hyclone公司；0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶、葡萄糖粉、甘露醇粉、T0901317、罗丹明123购自美国Sigma公司；胆重收缩素八肽(CCK8)溶液、细胞核蛋白提取试剂盒、ROS检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TRIzolreagent、聚合酶链反应引物购自美国Invitrogen公司；ROS检测试剂盒；5CPPSS-50购自日本Wako公司；荧光素标记物(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司；总蛋白提取试剂盒购自Vazyme有限公司；兔抗cleaved caspase-3多克隆抗体购自Cell Signaling公司；First-strand cDNA synthesis kit、All-in-One qPCR Mix购自美国GeneCopoeia公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分组从培养瓶中取对数期生长细胞传代计数，在6孔板或96孔板中按以下分组进行后续实验。实验分为①Control组：低糖DMEM培养基(D-葡萄糖浓度5.5 mmol/L)培养H9C2细胞24 h后换液，不进行任何干预，继续培养24 h；②甘露醇组：低糖DMEM培养基培养24 h后，更换为等渗D-甘露醇培养基继续培养24h；③高糖组：低糖DMEM培养基培养24 h后更换为配制好的D-葡萄糖终浓度为33 mmol/L的培养基继续培养24 h；④高糖+T0901317组：低糖DMEM培养基培养24 h后更换为配制好的D-葡萄糖终浓度为33 mmol/L的培养基并加入T0901317(终浓度10 μmol/L)继续培养24 h；⑤高糖+5CPPSS-50组：低糖DMEM培养基培养24 h后更换为配制好的D-葡萄糖终浓度为33 mmol/L的培养基并加入5CPPSS-50(终浓度15 μmol/L)继续培养24 h。

1.2.2CCK-8检测各组H9C2细胞的活性选取对数期生长的H9C2细胞进行传代计数，按每孔100 μl细胞悬液(约5 000个细胞)为标准，加入96孔板，每组设6个复孔，并预留只含等量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的空白对照组。在最外层的孔周加入磷酸盐缓冲液(PBS)以防止培养基蒸发；低糖DMEM培养基培养24 h后，相应组别更换为D-葡萄糖终浓度为33 mmol/L的培养基及D-甘露醇等渗培养基，并进行药物干预，24h后，每孔加入10 μl CCK-8；将96孔板置于培养箱内继续孵育2 h，再分别用酶标仪检测在450 nm处的OD值。细胞活性=〔(处理组-空白对照)/(正常组-空白对照)〕×100%。

1.2.3二氧二氢光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测各组细胞内ROS的水平按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L；收集细胞后重悬于稀释好的DCFH-DA中(1 ml)，37℃细胞培养箱内孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用流式细胞仪检测各样品内细胞活性氧水平。

1.2.4罗丹明123荧光染色观察线粒体膜电位的变化将5 mg罗丹明123粉末溶于1 ml二甲基亚砜(DMSO)中，配成罗丹明123母液备用；用培养基将罗丹明123母液稀释为5 μg/ml的工作液；将6孔板中的细胞用PBS洗涤2遍，向各孔加入1 ml罗丹明123工作液，37℃，5% CO2细胞培养箱孵育30 min；去除工作液，并用PBS洗涤2遍，荧光显微镜下观察各组细胞荧光强度变化。

1.2.5qRT-PCR检测各组H9C2细胞Bax、Bcl-2 mRNA的表达提取各组细胞RNA，分光光度计检测RNA纯度及浓度(RNA原液浓度(mg/L)=OD260 nm×40×稀释倍数，纯度要求达到OD260 nm/OD280 nm比值为1.8～2.1。按浓度计算出1 μg RNA逆转录合成cDNA，取2 μl cDNA进行qRT-PCR，以GADPH作为内参对照，检测Bax和Bcl-2的mRNA水平。每个样品均重复三次，ΔCt值=样本基因Ct值-对应内参Ct值；取Control组的ΔCt值的平均值作为对照，ΔΔCt值=每个样本ΔCt值-参照组的ΔCt值；计算出2-ΔΔCt值后再进行统计分析。

1.2.6Western印迹检测各组H9C2细胞酶切caspase-3蛋白的表达分别提取各组细胞总蛋白，测定蛋白的浓度，配制二喹啉甲酸(BCA)工作液，按试剂盒说明书稀释标准品并加适当体积样品到96孔板中；各孔加入200 ml BCA工作液育充分混匀后，置于37℃恒温箱中孵育30 min；以0号孔作为对照，用酶标仪测定562 nm处的吸光值；样品蛋白浓度(μg/μl)：根据OD值在标准曲线上对应的蛋白含量除以样品体积，再乘稀释倍数。取等量蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)和电转移至硝酸纤维素(NC)膜，先后用Ⅰ抗及Ⅱ抗孵育，按Supcrsignal west fomto trial kit试剂盒说明进行操作，通过ImageProPlus软件，分析目的蛋白与内参β-actin蛋白条带灰度值，计算相对灰度进行组间比较。

1.2.7Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡将6孔板中各组细胞用胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min，去除上清液，用PBS洗涤2次。将细胞重悬于200 μl上样缓冲液。加入10 μlannexin V-FITC和10 μl碘化吖啶(PI)，轻轻混匀，避光室温反应15 min。加入300 μl上样缓冲液，在1 h内用流式细胞仪检测。

1.3统计学方法应用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1CCK-8法检测各组H9C2细胞的活性与Control组(100%)相比，高糖组(62.76±1.34)%、高糖+T0901317(83.23±2.17)%、高糖+5CPPSS-50组(56.48±1.41)%细胞活性均降低(P<0.05)，而甘露醇组与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组相比，高糖+T0901317细胞活性较高，高糖+5CPPSS-50组细胞活性降低(P<0.05)。见图1。

2.2DCFH-DA法检测各组细胞内ROS水平与Control组(24.65±1.83)相比，高糖组ROS生成水平(62.06±1.94)明显升高(P<0.01)，甘露醇组(26.64±1.18)无明显变化(P>0.05)；与高糖组相比，高糖+T0901317组(47.51±1.90)ROS生成水平降低(P<0.01)，高糖+5CPPSS-50组(77.8±2.68)ROS生成水平升高(P<0.01)。

2.3罗丹明123检测H9C2细胞线粒体膜电位变化Control组与甘露醇组荧光强度最高，且二者无明显差异；与Control组相比，高糖+T0901317组、高糖组、高糖+5CPPSS-50组荧光强度均减弱；与高糖组相比，高糖+T0901317组荧光强度较强，高糖+5CPPSS-50组荧光强度稍弱。见图1。

2.4qRT-PCR检测各组H9C2细胞Bax和Bcl-2 mRNA的表达以Control组(表达量为1)进行比较，高糖+T0901317组(10.58±1.70)、高糖组(27.10±0.83)、高糖+5CPPSS-50组(47.19±1.58)Bax mRNA表达水平均上调，其中高糖组Bax 的mRNA表达是Control组的27.10±0.83倍，高糖+5CPPSS-50组Bax mRNA表达是Control组的47.19±1.58倍，高糖+T0901317组的Bax mRNA表达是Control组的10.58±1.70倍，差异均有明显的统计学意义(P<0.01)；而甘露醇组(1.12±0.32)与Control组相比，差异无明显统计学意义(P>0.05)。与高糖组相比，高糖+T0901317组Bax mRNA表达水平下调(P<0.01)，而高糖+5CPPSS-50组Bax mRNA表达水平上调(P<0.01)。以Control组表达量为1进行比较，甘露醇组Bcl-2的mRNA表达为Control组的0.95±0.04倍，差异无统计学意义(P>0.05)；高糖组Bcl-2的mRNA表达为Control组的0.04±0.03倍；高糖+T0901317组Bcl-2的 mRNA表达为Control组的0.23±0.05倍，差异有统计学意义(P<0.01)；高糖+5CPPSS-50组Bcl-2的mRNA表达为Control组的0.02±0.01倍。与高糖组相比，高糖+T0901317组Bcl-2的mRNA表达水平上调(P<0.01)，而高糖+5CPPSS-50组Bcl-2的mRNA表达水平下调(P<0.01)。

2.5Western印迹检测各组H9C2细胞酶切caspase-3蛋白的表达与高糖组(0.52±0.05)相比，高糖+T0901317组(0.83±0.04)的酶切caspase-3蛋白水平下调(P<0.01)；高糖+5CPPSS-50组(0.97±0.05)的酶切caspase-3蛋白水平上调(P<0.01)；而甘露醇组(0.33±0.06)与Control组(0.32±0.03)相比差异无统计学意义(P>0.05)(见图2)。

图1　各组H9C2细胞线粒体膜电位(E×/Em:505×529)

图2　各组酶切caspase-3蛋白表达

2.6Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡与Control组(21.25±1.57)相比，高糖组凋亡率明显上升(P<0.01)，甘露醇组(22.67±1.64)凋亡率无明显改变(P>0.05)；与高糖组(48.12±2.81)相比，高糖+T0901317组(34.52±2.95)凋亡率有所降低(P<0.01)，高糖+5CPPSS-50组(55.20±2.96)凋亡率上升(P<0.01)。

3讨论

糖尿病心肌病的病理过程极其复杂，葡萄糖脂肪酸代谢紊乱、心肌纤维化、氧化应激、钙平衡调节异常、RAAS的激活、心肌细胞凋亡等多种因素等都参与了糖尿病心肌病的发生、发展。高糖环境中，线粒体内ROS的过量生产，使线粒体膜通透性增加，线粒体内致凋亡因子释放增多，通路相关信号通路，加速细胞凋亡。LXRs在能量代谢、炎症、凋亡及RASS中起着关键的调节作用。线粒体内含有多种凋亡相关因子，如细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)caspase-2，3，9等，凋亡过程中通过线粒膜释放到细胞质中，随后引起特异性凋亡发生。同时多种促凋亡蛋白及凋亡诱导物可转移至线粒体，破坏线粒体膜的通透性和完整性，加速线粒体内促凋亡因子的释放，进一步使凋亡细胞增多〔3〕。ROS是线粒体呼吸链产生的一个导致氧化损伤和老化的破坏性产物，大量研究证实，ROS的积聚和氧化应激可导致线粒体膜电位及通透性的改变，最终与心肌细胞凋亡的发生相关。Fiordaliso等〔4〕在用链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病心肌病模型中发现，心肌细胞内ROS水平会伴随细胞凋亡的增加而成倍上升。细胞色素C释放是线粒体凋亡途径的关键步骤〔5〕，Bax、Bcl-2的相互作用可诱导线粒体细胞色素C的释放和caspase-3的激活〔6〕。Cai等〔7〕研究显示在大鼠糖尿病心肌病模型中伴随心肌细胞的凋亡增多，线粒体细胞色素C的释放和caspase-3的活性也增加，并且与在高糖环境中体外培养心肌细胞得出的结论相一致。这说明，线粒体细胞色素C调节caspase-3的激活参与了高糖诱导的心肌细胞凋亡。同时细胞色素C的释放和caspase-3活化间存在着互相的正反馈调节机制〔8〕，导致凋亡信号放大，细胞线粒体功能丧失和细胞死亡。

糖尿病状态下，RAAS被激活，血浆及心肌局部的血管紧张素(Ang)Ⅱ合成增加，而有研究观察到Ang-Ⅱ介导的氧化应激可诱导糖尿病大鼠心肌细胞发生凋亡〔9〕。唐香等〔10〕研究表明通过降低糖尿病大鼠氧化应激水平，可减少或抑制心肌线粒体ROS 的产生。已有研究发现，LXRs激动剂T0901317可减轻由Ang-Ⅱ及LPS诱导的心肌细胞损伤，这也揭示了LXRs与线粒体凋亡途径的相关性。同时在高糖环境下，NF-κB信号通路也被激活〔11〕，NF-κB可促进炎症因子的产生，而这些促炎症因子可增强caspase 3的活性，刺激NF-κB的不断活化，活化后的NF-κB可促进凋亡相关基因的表达，诱导细胞凋亡的产生〔12〕。乳鼠心肌细胞复制缺氧复氧模型中，外源性激活LXRs可通过抑制NF-κB活性，从而减轻心肌细胞炎症及凋亡的产生〔13〕，提示NF-κB可能是线粒体凋亡途径的上游信号分子。本实验结果表明，T0901317组与高糖组相比，Bax mRNA、激活型caspase3蛋白水平下降；Bcl-2 mRNA表达水平明显升高。而5CPPSS-50组Bax mRNA、激活型caspase3蛋白水平升高；Bcl-2 mRNA表达水平明显降低，表明LXRs可通过线粒体的caspase依赖性凋亡途径调控高糖诱导的H9C2细胞凋亡。但LXRs能否通过线粒体的caspase非依赖性凋亡途径调控高糖诱导的H9C2细胞凋亡有待进一步研究。

4参考文献

1Oldenburg O，Qin Q，Krieg T，etal.Bradykinin induces mitochondrial ROS generation via NO，cGMP，PKG，and mitoKATP channel opening and leads to cardioprotection〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004；286(1)：H468-76.

2Glass CK，Ogawa S.Combinatorial roles of nuclear receptors in inflammation and immunity〔J〕.Nat Rev Immunol，2006；6(1)：44-55.

3Cain K，Bratton SB，Cohen GM.The Apaf-1 apoptosome：a large caspase-activating complex〔J〕.Biochimie，2002；84(2-3)：203-14.

4Fiordaliso F，Bianchi R，Staszewsky L，etal.Antioxidant treatment attenuates hyperglycemia-induced cardiomyocyte death in rats〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2004；37(5)：959-68.

5Varga E，Nagy N，Lazar J，etal.Inhibition of ischemia/reperfusion-induced damage by dexamethasone in isolated working rat hearts：the role of cytochrome c release〔J〕.Life Sci，2004；75(20)：2411-23.

6Wolter KG，Hsu YT，Smith CL，etal.Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis〔J〕.J Cell Biol,1997；139(5)：1281-92.

7Cai L，Li W，Wang G，etal.Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium：mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway〔J〕.Diabetes,2002；51(6)：1938-48.

8Guan L，Han B，Li Z，etal.Sodium selenite induces apoptosis by ROS-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction in human acute promyelocytic leukemia NB4 cells〔J〕.Apoptosis，2009；14(2)：218-25.

9Wu S，Yin R，Ernest R，etal.Liver X receptors are negative regulators of cardiac hypertrophy via suppressing NF-kappaB signalling〔J〕.Cardiovasc Res,2009；84(1)：119-26.

10唐香，程训民，江时森，等.替米沙坦对1型糖尿病大鼠氧化应激的影响〔J〕.解放军医学杂志，2010；(7)：788-91.

11Boudina S，Sena S，O′Neill BT，etal.Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity〔J〕.Circulation，2005；112(17)：2686-95.

12Hamid T，Gu Y，Ortines RV，etal.Divergent tumor necrosis factor receptor-related remodeling responses in heart failure：role of nuclear factor-kappaB and inflammatory activation〔J〕.Circulation，2009；119(10)：1386-97.

13殷然，王梦洪，郑泽琪，等.肝X受体抑制乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤〔J〕.中国病理生理杂志，2011；27(9)：1671-5.

〔2015-12-03修回〕

(编辑袁左鸣)

Liver X receptors regulating H9C2 cells apoptosis induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway

WANG Yun-Kai,TAO Jian，LI Wei-Yong,et al.

Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Hypertension Institute of Jiangxi,Nanchang 330006,Jiangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the viability and apoptosis level of H9C2 cells induced by high glucose and investigate the effect of liver X receptors(LXRs)on the regulation of apoptosis in H9C2 cells induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway.MethodsH9C2 cells were used in the experiments and divided into:low glucose group(control group);D-mannitol group;high glucose group;high glucose +T0901317 group and high glucose +5CPPSS-50 group.The viability and the level of ROS in the H9C2 cells were measured.The mRNA expressions of Bax and Bcl-2 were detected by qRT-PCR.The protein level of cleaved caspase 3 was determined by Western blot.The apoptotic rates of H9C2 cells with different treatments were analyzed by cytometry with annexin V-FITC/PI double staining.ResultsOverexpressed LXRs significantly attenuated the mRNA expression of Bax induced by high glucose,cleaved caspase-3,cell viability and the ROS lever,and increased Bcl-2 expression and mitochondrial membrane potential inhibited by high glucose.ConclusionsT0901317 improves the cell viability and reduces the apoptotic rate of H9C2 cells induced by high glucose，while inhibits the LXRs damage effect more obvious in H9C2 cells induced by high glucose.LXRs can regulate apoptosis in H9C2 cells induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway.

【Key words】High glucose;LXRs;Apoptosis;Mitochondria-mediated pathway

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81160117)

〔中图分类号〕R329.24

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2324-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.006

1江西省肿瘤医院

第一作者：王云开(1963-),男，硕士，主任医师，硕士生导师，主要从事冠心病基础和临床研究。