三种不同造模方法建立大鼠急性胰腺炎模型的对比

刘大晟　吴先林　李接兴　罗羽宏

(广东省中医院普外科，广东　广州　510120)

三种不同造模方法建立大鼠急性胰腺炎模型的对比

刘大晟吴先林1李接兴2罗羽宏2

(广东省中医院普外科，广东广州510120)

〔摘要〕目的采用雨蛙肽、L-精氨酸、牛磺胆酸钠作为诱导剂建立大鼠急性胰腺炎(AP)动物模型，通过大鼠病理评分、血清生化及炎症细胞因子指标检测，找出一种操作简单、重复性好的大鼠AP造模方法。方法采用不用造模方法处理后的大鼠在不同时间点采集血液及胰腺标本。检测指标有淀粉酶(AMY)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α及胰腺组织病理评分。结果雨蛙肽组大鼠血清检查结果及胰腺病理均符合轻型AP改变，L-精氨酸及牛磺胆酸钠组血清检查结果及胰腺病理均符合重症AP改变。结论三种方法均可成模，大鼠AP模型病情最重的是牛磺胆酸钠诱导组，其次为L-精氨酸诱导组，病情最轻为雨蛙肽诱导组。

〔关键词〕急性胰腺炎；雨蛙肽；L-精氨酸；牛磺胆酸钠

急性胰腺炎(AP)发生初期，血液中产生大量抗炎细胞因子、炎症介质及氧自由基，炎症介质之间相互作用，从而导致“炎症介质瀑布样级联效应”〔1，2〕。炎症介质的级联效应失控后迅速导致SIRS，并可进一步发展为MODS。在临床中直接进行AP的相关临床试验存在诸多限制，因此，学者们致力于建立AP模型进行研究其发病机制及用药等。本实验采用雨蛙肽腹腔注射、L-精氨酸腹腔注射、经十二指肠胰胆管逆行穿刺注射牛磺胆酸钠等3种方法建立大鼠AP模型，观察大鼠造模过程中血清生化指标及炎症因子水平动态变化，结合胰腺组织石蜡切片进行病理评分，综合评价3种大鼠AP模型严重程度及造模方法优劣，寻找AP的最优造模方法。

1材料与方法

1.1实验动物及分组健康雄性SPF级SD大鼠128只，采用完全随机分组法分为空白对照组、雨蛙肽诱导组、L-精氨酸诱导组、牛磺胆酸钠诱导组，每组32只，每组组内再根据4个时间点随机分为4个亚组(6、12、24、48 h)，每个亚组8只。

1.2实验动物处理空白对照组不予特殊处理。雨蛙肽诱导组：以50 μg·kg-1·h-1的诱导剂量，每隔1 h注射1次，共注射6次。L-精氨酸诱导组：采用L-精氨酸腹腔注射的方法，用配制好的20%L-精氨酸溶液腹腔注射，剂量为2.5 g/kg体重，间隔1 h注射1次，共注射2次。牛磺胆酸钠诱导组：采用异氟烷吸入麻醉，以0.1 ml/min经十二指肠胰胆管逆行缓慢匀速注入5%牛磺胆酸钠溶液(1 ml/kg)。

1.3实验标本在末次处理后的第6、12、24、48小时各取8只大鼠，再以异氟烷吸入麻醉，采用心脏注射器穿刺直接采血法采集血液并处死大鼠，提取血清以检测淀粉酶(AMY)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Ca2+、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。取大鼠胰腺组织，固定于4%多聚甲醛溶液中备做石蜡切片。

1.4统计学分析应用SPSS16.0软件行析因设计方差分析。

2结果

2.1大鼠血清炎症因子结果TNF-α和IL-6在牛磺胆酸钠诱导组和L-精氨酸诱导组都明显升高，而IL-10则在雨蛙肽组较高。从生化结果看，三种不同造模方法均可使大鼠血清AMY明显上升，并随时间推移而变化。雨蛙肽诱导组大鼠ALT、BUN、Cr水平改变不明显，说明其肝肾功能无明显损伤，L-精氨酸诱导组大鼠血清ALT、BUN、Cr有不同程度上升，但其水平不及牛磺胆酸钠诱导组，说明牛磺胆酸钠诱导组AP大鼠的肝肾功能损伤更严重。L-精氨酸诱导组与牛磺胆酸钠诱导组Ca2+水平在48 h均明显下降，且与雨蛙肽诱导组相比有较明显下降。从三组模型胰腺病理评分看，L-精氨酸诱导组与牛磺胆酸钠诱导组病理评分峰值明显高于雨蛙肽组，见表1～表3。

2.2胰腺石蜡切片结果空白对照组胰腺结构完整，无细胞水肿，胰管走形正常，未见小叶间间隙增宽，无出血坏死，偶见炎症细胞。雨蛙肽诱导组胰腺细胞弥漫性水肿，小叶结构稍紊乱，可见点状出血坏死灶，中量炎症细胞浸润。L-精氨酸诱导组胰腺结构紊乱，弥漫性小叶间水肿，实质出血明显，大量炎症细胞浸润。牛磺胆酸钠诱导组胰腺结构紊乱，弥漫性水肿，细胞明显胀大，弥漫性出血坏死灶，大量炎症细胞浸润，见图1。

表1　血清IL-6、IL-10、TNF-α测定结果

表2　血清AMY、ALT、BUN、Cr、Ca2+、SOD、胰腺病理评分测定结果

表3　各实验组实验指标析因设计方差分析

图1　各组胰腺石蜡切片病理结果(×200)

3讨论

雨蛙肽是胆囊收缩素(CCK)类似物，含有14个氨基酸残基，可以刺激胃肠道激素分泌〔3〕。雨蛙肽诱导AP的机制是通过CCK受体，刺激胰腺腺泡，激活溶酶体酶水解组织蛋白B，导致胰蛋白酶原激活成胰蛋白酶，从而导致胰腺的“自我消化”〔4〕。雨蛙肽可以在大鼠、小鼠、兔、狗、猪等动物中成功诱发AP，且其胰腺病理变化与人类AP病理变化非常类似。1977年，Lampel等〔5〕最先将雨蛙肽用于建立大鼠AP模型，并成功建立了MAP模型。本实验采用雨蛙肽按50 μg/kg剂量重复6次腹腔注射方法建立AP模型，结果显示，雨蛙肽诱导组大鼠血清AMY明显上升，并在12 h内迅速上升到较高水平，至24 h血清AMY仍维持在这一水平，与文献相符。该组AP模型血清ALT、血清BUN、血清Cr水平上升不明显，Ca2+水平降低程度不如另外两个诱导组，提示该模型对肝肾功能损伤较小，病情较轻。结合IL-6、TNF-α水平提示该模型炎症因子水平较其余两个诱导组低，病理切片观察胰腺坏死程度也相对较轻，因此我们认为雨蛙肽腹腔注射法建立的AP模型为MAP。

L-精氨酸大剂量腹腔注射法建立大鼠AP模型最早由Mizunuma等〔6〕报道，随后该模型被广泛应用。目前机制尚不清楚，可能与L-精氨酸诱导产生氧自由基、一氧化氮或释放炎症介质有关〔7，8〕。现已证实，L-精氨酸在一氧化氮合成酶(NoS)催化下生成一氧化氮(NO)〔9〕。L-精氨酸在AP中有双重作用，在生理剂量时L-精氨酸及其代谢产物NO可以维持各系统功能，改善胰腺微循环，防止血栓形成，对AP起到保护及减轻胰腺损伤的作用〔10〕。另一方面，当大剂量给予L-精氨酸时在机体产生大量NO，NO作为自由基也可以对细胞产生损伤，促使AP的发生及加重其病情〔11〕。本实验采用20%L-精氨酸按2.5 g/kg分两次腹腔注射，结果显示L-精氨酸腹腔注射后血清AMY水平迅速上升，在24 h达到峰值，在48 h有所下降。病理切片结果显示在24 h胰腺组织出血坏死明显，大量炎症细胞浸润，符合SAP诊断。另外，该模型血清ALT、血清BUN、血清Cr水平升高，提示有肝肾功能损害，结合血清IL-6、TNF-α上升明显，说明该模型为SAP模型。实验结果显示，在12～24 h检测点检测生化指标及炎症因子水平为最严重，但48 h时均有不同程度好转，据此我们认为，该模型胰腺组织发生坏死在造模后24 h最严重，随后可能有自愈倾向。

牛磺胆酸钠经胰胆管逆行注射法造模是常用的经典造模方法之一〔12〕。牛磺胆酸钠是两种胆汁酸的主要成分之一，该造模方式模拟胆总管下段梗阻时胆汁反流入胰胆管时引起的AP，而胆源性AP在临床中占总病例数的大部分，因此该模型在研究AP时较为广泛应用。本实验采用5%牛磺胆酸钠经胰胆管逆行注射的方法建立AP模型，实验结果显示造模后6 h血清AMY就迅速上升，并能达到较高水平。血清生化如ALT、BUN、Cr等指标有明显改变，血清Ca2+、SOD水平下降明显，血清IL-6、IL-10、TNF-α水平较空白对照组有明显改变，说明牛磺胆酸钠建立AP模型病情严重，可导致MODS。胰腺病理切片可观察到胰腺组织出血坏死明显，大量炎症细胞浸润，是典型SAP征象。

雨蛙肽方法建立的AP模型病情相对较轻，简单、无创，重复性好，是建立轻型大鼠AP模型的理想方法。L-精氨酸按方法同样具有简单、无创、重复性好等优点。牛磺胆酸钠经十二指肠胰胆管逆行穿刺方法可以成功快速建立大鼠AP模型，且建立的AP模型病情重，血清生化指标及炎症因子等改变明显，是建立合并有器官功能损伤的SAP模型理想的方法。综上，在相同时间点分析3种建立AP模型方法，大鼠AP模型病情最重的是牛磺胆酸钠诱导组，其次为L-精氨酸诱导组，病情最轻为雨蛙肽诱导组。

4参考文献

1Lankisch PG，Apte M，Banks PA.Acute pancreatitis〔J〕.Lancet，2015；386(9988)：85-96.

2Mews P，Philips P，Fahmy R，etal.Pancreatic stellate cells respond to inflammatory cytokines：potential role in chronic pancreatitis〔J〕.Gut，2002；50(4)：535-41.

3Bhatia M，Saluja AK，Hofbauer B，etal.Role of substance P and the neurokinin 1 receptor in acute pancreatitis and pancreatitis-associated lung injury〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1998；95：4760-5.

4Saluja AK，Bhagat L，Lee HS，etal.Secretagogue-induced digestive enzyme activation and cell injury in rat pancreatic acini〔J〕.Am J Physiol，1999；276(4)：835-42.

5Lampel M，Kern HF.Acute interstitial pancreatitis in the rat induced by excessive doses of a pancreatic secretagogue〔J〕.Virchows Arch A Pathol Anat Histol，1977；373(2)：97-117.

6Mizunuma T，Kawamura S，Kishino Y.Effects of injecting excess arginine on rat pancreas〔J〕.J Nutr，1984；114(3)：467-71.

7Hegyi P，Rakonczay Z Jr，Sari R，etal.L-arginine-induced experimental pancreatitis〔J〕.World J Gastroenterol，2004；10(14)：2003-9.

8Dawra R，Sharif R，Phillips P，etal.Development of a new mouse model of acute pancreatitis induced by administration of L-arginine〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007；292(4)：1009-18.

9Lin Z，Liu Y，Zheng Q，etal.Increased proportion of nitric oxide synthase immunoreactive neurons in rat ileal myenteric ganglia after severe acute pancreatitis〔J〕.BMC Gastroenterol，2011；23(11)：127.

10Sanchez-Bemal C，Garcia-Morales OH，Dominguez C，etal.Nitric oxide protects against pancreatic subcellular damage in acute pancreatitis〔J〕.Pancreas，2004；28(1)：915.

11Takacs T，Czako L，Morschl E，etal.The role of nitric oxide in edema formation in L-arginine Y induced acute pancreatitis〔J〕.Pancreas,2002；25：277-82.

12Chan YC，Leung PS.Acute pancreatitis：animal models and recent advances in basic research〔J〕.Pancreas，2007；34(1)：1-14.

〔2015-12-03修回〕

(编辑李相军)

Comparative study in acute pancreatitis rat models induced by three different methods

LIU Da-Sheng，WU Xian-Lin，LI Jie-Xing，et al.

Department of General Surgery,the Hospital of Guangdong of TCM,Guangzhou 510120,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo find out a simple and reproducible methods of acute pancreatitis(AP)model rat.MethodsRats were received different methods to set up AP rat models.Serum biochemical indicators and pancreas specimens of the four groups rats were tested after AP induction.The levels of AMY,ALT,BUN,Cr,Ca2+,SOD,IL-6,IL-10,TNF-α were detected,and pathological scores of pancreas tissues were measured.ResultsSerum indicators and pathological score of caerulein group were in line with mild AP,yet those of L-arginine and sodium taurocholate group were in line with severe AP.ConclusionsThe models of AP rat could be established successfully by the three ways，the model induced by sodium taurocholate was the most serious illness and the caerulein was the lightest condition according to the three experimental groups at the same time point.

【Key words】Acute pancreatitis;Caerulein;L-arginine;Sodium taurocholate

基金项目：国家自然科学基金资助(No.81403302)；广东省自然科学基金资助(2014A030310477)；中央高校基本科研业务费专项资金资助(No.21614306)

通讯作者：罗羽宏(1963-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事普外科疾病的诊治研究。

〔中图分类号〕R57

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2315-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.003

1暨南大学附属第一医院中西医结合胰腺病诊治中心

2暨南大学附属第一医院肝胆外科

第一作者：刘大晟(1989-)，男，硕士，医师，主要从事普外科疾病的诊治研究。