当归对阴虚哮喘BALB/c小鼠肺水通道蛋白1、5表达的影响

李荣科　李海龙　王志旺　程小丽　李　岩　陈张敏　妥海燕　任　远

(甘肃中医药大学，甘肃　兰州　730000)

·基础研究·

当归对阴虚哮喘BALB/c小鼠肺水通道蛋白1、5表达的影响

李荣科李海龙王志旺1程小丽李岩陈张敏妥海燕任远1

(甘肃中医药大学，甘肃兰州730000)

〔摘要〕目的探讨当归对阴虚哮喘小鼠的平喘作用及对水通道蛋白(AQP)1、AQP5表达的影响。方法将小鼠随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松组、3个当归剂量组、当归与地塞米松组，通过注射卵清白蛋白(OVA)致敏、吸入OVA激发复制哮喘模型，实验后期给予甲状腺素复制成阴虚哮喘BALB/c小鼠模型，观测当归对哮喘发作鼠数、肺液清除功能、肺组织AQP1、AQP5及其基因表达的影响。结果2、4、8 g/kg当归可明显减少哮喘发作鼠数，促进肺水代谢平衡，促进肺组织AQP1、AQP5及其基因的表达(P<0.05，0.01)。同时，当归与地塞米松配伍后对AQP1、AQP5及其基因表达有一定的协同作用(P<0.05)。结论当归治疗哮喘的机制之一是调节AQP1、AQP5及其基因表达而促进肺水代谢平衡。

〔关键词〕当归；阴虚哮喘；水通道蛋白1；水通道蛋白5

当归为大宗中药材之一，其“主咳逆上气”、防治呼吸系统疾病的作用〔1〕一直受到中医药学界的重视。研究显示，当归及其制剂对哮喘有明显的治疗作用，当归挥发油对豚鼠气管平滑肌有明显的解痉作用〔2〕。水通道蛋白(AQPs)在调节水代谢平衡及炎性反应过程中具有重要作用〔3〕。本次实验采用卵清白蛋白(OVA)与甲状腺素复制阴虚哮喘小鼠模型，拟从肺组织AQP1、AQP5的表达来探讨当归的平喘作用机制。

1材料与方法

1.1动物、试药及主要仪器雌性SPF级BALB/c小鼠，体质量16～20 g，由兰州兽医研究所(中国农业科学院)提供，动物许可证62000600000082；实验动物中心(甘肃中医药大学)饲养，使用号00000115。甘肃省岷县的当归，经本校杨扶德教授鉴定，购买时间：2014年10月18日；Grade V Sigma公司的OVA、磷酸组胺(Hist)及氯化乙酰胆碱(Ach)，批号：SLBF0342V、WXBB2337V、BCSK5705V；山东中泰药业有限公司的甲状腺片，国药准字H37021712，批号14080303；国药集团容生制药有限公司的地塞米松注射液，国药准字H41020036，批号13011911；北京博奥森生物技术有限公司的AQP1、AQP5免疫组化试剂盒，批号：AD091513、AD111342；日本TaKaRa公司的RNAico Plus，批号：AA1608-1；日本TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒，批号：AK3501。将当归药材阴干后，闷润切片，阴干，冷冻储存；实验时，取当归适量，分别加入10倍、8倍量水，煎煮50、30 min，过滤，合并滤液，适当浓缩，1℃～5℃冷藏，1 w内使用。USA的鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系统(CH Technologies)，美国伯乐公司的Real-Time荧光定量PCR仪(CFX型)，澳大利亚Dynamica公司的台式冷冻离心机(VELOCITY18R型)，日本Olympus的光学显微镜(CH-212型)，成都泰盟科技有限公司的医学图像分析系统(BI-2000型)。

1.2实验方法

1.2.1分组、造模及给药将84只BALB/c小鼠随机分为7组，适应性饲养1 w。实验第1天开始致敏，即模型对照组、地塞米松组(地塞米松0.5 mg/kg)、当归高、中、低剂量组(当归8、4、2 g/kg)以及当归中+地米组(当归、地塞米松分别为4 g/kg、0.5 mg/kg)小鼠每只腹腔注射新鲜配制的致敏液〔内含OVA 100 μg、氢氧化铝3 mg的生理盐水(NS)混悬液〕0.2 ml，同时背部皮下注射致敏液0.2 ml，正常对照组以NS代替致敏；第8天依上法再致敏一次。从第15天开始激发，将小鼠置于吸入染毒系统中，加入激发液(1% OVA生理盐水)，调节雾化速度至2 ml/min，使小鼠均匀吸入激发液20 min，隔日1次，连续28 d，正常对照组以NS代替激发。从实验第15天开始，各组小鼠按上述剂量灌胃给药20 ml/kg，其中正常对照组与模型对照组灌胃NS，1次/d，连续28 d。从第29天开始，小鼠给受试药8 h后，按120 mg/kg灌胃甲状腺素(用0.5%黄原胶助悬)〔4〕，1次/d，连续14 d，正常对照组灌胃NS 20 ml/kg。

1.2.2支气管激发实验在实验过程中的第41天与第42天进行。分别以2%OVA与0.2% Hist和2% Ach混合物为激发液，将小鼠置于吸入染毒暴露系统内，2 ml/min雾化吸入激发液120 s，从雾化开始观察10 min内哮喘发作的鼠数。哮喘发作的症状主要有呼吸急促，呼吸频率明显加快、焦躁不安，甚至呼吸过程中急促点头、腹式呼吸等〔5〕。

1.2.3采集标本、测定指标实验第43天，麻醉并处死动物后摘取肺脏，于固定位置将肺脏分成3份：第1份肺组织准确称取湿重，充分干燥至恒重后称取干重，计算湿干重比值(W/D)；第2份肺组织经甲醛固定、石蜡包埋、切片后免疫组化染色等步骤观察AQP1、AQP5的表达并进行半定量分析；第3份肺组织经NS漂洗后冷冻，采用Real-time qPCR法测定AQP1、AQP5 mRNA的表达水平。

1.2.4采用Real-time qPCR法测定肺组织AQP1的基因表达采用经典的Trizol法提取总RNA，应用Bio-RAd核酸定量分析仪测定RNA的纯度与浓度，使A260 nm/A280 nm在1.8～2.0。按照PrimeScripTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA。以cDNA为模板对小鼠内参照β-actin及AQP1、AQP5基因进行PCR扩增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，β-actin引物序列：上游为GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG，下游为ATGCCACAGGATTCCATACC；AQP1引物序列：上游为ACCTGFTGGCGATTGACTAC，下游为CACCTTCATGCGGTCTGTGA；AQP5引物序列：上游为GCTCCGAGCCATCTTCTACG，下游为GTGTTGTTGCTGAGCGCATT。实时荧光定量PCR反应是在美国伯乐公司的CFX型Real-Time荧光定量PCR仪上进行，建立10 μl反应体系，检测内标基因β-actin及AQP1表达荧光强度达到设定区域时所经历的循环数(Ct值)。以内标基因β-actin的Ct值为对照计算△Ct，以模型对照组为对照计算△△Ct，采用2-ΔΔCt法计算目标基因相对表达量。

1.3统计学方法应用SPSS11.5软件行单因素方差分析及χ2检验。

2结果

2.1当归对阴虚哮喘小鼠支气管激发中哮喘发作动物数的影响模型对照组吸入激发液后哮喘鼠数明显增加(P<0.05，0.01)；经当归治疗后，哮喘鼠数下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.2当归对阴虚哮喘小鼠肺液清除功能的影响哮喘早期的急性炎症期，肺组织处于充血水肿状态，水液含量高；哮喘中后期逐渐转向以结缔组织增生为主，肺组织间液逐渐减少。模型对照组小鼠肺组织湿重干重比明显下降(P<0.01)；经当归干预后，肺组织湿重干重比不同程度上升，其中高、中剂量组与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。此外，当归中+地米组肺湿重干重比较高，与地塞米松组比较有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3当归对阴虚哮喘小鼠肺组织中AQP1、AQP5蛋白表达水平的影响在高倍镜下呈蓝色颗粒者为AQP1、AQP5表达阳性细胞。小鼠肺组织AQP1主要表达于气管腔上皮细胞、支气管黏膜下腺上皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞及肺组织的血管内皮细胞；AQP5主要表达于肺泡Ⅰ型细胞的顶膜面、支气管纤毛柱状上皮细胞的顶膜面、黏膜下腺体、肺泡上皮细胞等部位。对肺组织AQP1、AQP5半定量分析显示，模型对照组AQP1、AQP5的平均光密度明显降低(P<0.01)；经当归干预后，AQP1、AQP5的表达增强，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表2；图1，图2。

表1　当归对阴虚哮喘小鼠支气管激发中哮喘发作鼠数、

与模型对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与地塞米松组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

表2　当归对阴虚哮喘小鼠肺组织中AQP1、AQP5蛋白表达

2.4当归对阴虚哮喘小鼠肺组织AQP1、AQP5基因表达的影响每组随机取6个标本进行实验，PCR结果中基因扩增曲线和溶解曲线一致性较好，实验具有可重复性。与正常对照组比较，模型对照组的AQP1 mRNA与AQP5 mRNA表达水平显著下降(P<0.01)；经当归干预后，AQP1 mRNA与AQP5 mRNA表达水平明显上升，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)。同时，与地塞米松组比较，当归油中+地米组AQP1 mRNA与AQP5 mRNA表达水平上升的更明显(P<0.05)，显示出一定的协同作用。见表3。

A：正常对照组；B：模型对照组；C：地塞米松组；D：当归高剂量组；E：当归中剂量组；F：当归低剂量组；G：当归中+地米组；下图同图1　小鼠肺组织中AQP1表达水平的免疫组化分析(×40)

图2　小鼠肺组织中AQP5表达水平的免疫组化分析(×40)

表3　当归对阴虚哮喘小鼠肺组织AQP1 mRNA、

3讨论

支气管哮喘(简称哮喘)严重影响人们的生活质量〔6〕。尽管已经采取包括吸入糖皮质激素在内的综合抗炎治疗方案，但由于环境污染、人均寿命的延长，哮喘的发病率、死亡率并没有随之而降低〔5〕，仍然迫切需要去寻找新的方法来防治哮喘。自《神农本草经》记载当归“主咳逆上气”以来，历代中医典籍均有当归防治呼吸系统疾病的理论与临床应用。本次研究采用OVA与甲状腺素复制慢性阴虚哮喘动物模型〔7〕，实验结果显示，当归可明显减少阴虚哮喘模型哮喘发作动物数，具有明显的平喘作用。

当归“主咳逆上气”的中医药理论基础是当归具有补血养阴、活血行气、布津润燥的功效，而机体阴血津液的主要组成成分是水，所以当归“主咳逆上气”、防治哮喘的作用基础是对肺脏水分的分布及伴随而来的生理、病理功能的调节作用。现代研究显示，水通道蛋白对肺脏水分的分布及其功能的实现显得尤为重要〔8〕。呼吸道和肺组织中的AQPs主要有AQP1、AQP5等，肺部AQP1主要分布于支气管周围血管床和淋巴管脏层胸膜，为血管与肺间质之间的水转运快速通道，维持正常肺组织的通气和换气功能；AQP5在呼吸道和肺组织中分布最广，主要参与构成血气屏障气体侧的水分子通路，维持气管与肺泡腔内的水代谢平衡，调节气道液体的黏稠度〔9〕。本次实验结果显示，当归可促进肺组织AQP1、AQP5及其基因的表达，提高阴虚型慢性哮喘的肺组织湿干重比值，促进肺水代谢平衡而实现肺组织水分的生理功能。

4参考文献

1章辰芳，孔繁智.当归对呼吸系统作用的研究概况〔J〕.中草药，1999；30(4)：311-3.

2吴国泰，任远，王锋，等.当归挥发油不同部位对豚鼠离体气管平滑肌的作用及机制研究〔J〕.甘肃中医学院学报，2011；28(4)：1-4.

3张君，骆仙芳，王会仍.肺水通道蛋白与支气管哮喘〔J〕.中华哮喘杂志(电子版)，2013；7(1)：39-43.

4贺玉伟，柴程芝，寇俊萍，等.甲状腺素诱导小鼠模型表观指征变化与阴虚火旺证的相关性研究〔J〕.实验动物科学，2013；30(2)：1-6.

5王志旺，孙少伯，王永辉，等.当归挥发油对哮喘大鼠的平喘作用及其对IL-4、IFN-γ的影响〔J〕.免疫学杂志，2013；29(5)：391-4.

6李孟荣.变应性哮喘特异性免疫治疗进展〔J〕.中华实用儿科临床杂志，2012；27(16)：1226-9.

7马子风，尹磊淼，冉君，等.小鼠过敏性哮喘模型制备的特点分析〔J〕.东南大学学报(医学版)，2014；33(5)：650-5.

8Ablimit A，Hasan B，Lu W，etal.Changes in water channel aquaporin 1 and aquaporin 5 in the small airways and the alveoli in a rat asthma model〔J〕.Micron，2013；45：68-73.

9郭之强，颜春松.水通道蛋白与哮喘〔J〕.生命的化学，2010；30(5)：788-91.

〔2015-12-03修回〕

(编辑袁左鸣)

Effects of RASI on the expressions of aquaporin-1 and aquaporin-5 in lung of asthmatic mice with Yin deficiency syndrome

LI Rong-Ke,LI Hai-Long,WANG Zhi-Wang,et al.

Gansu University of TCM,Lanzhou 730000,Gansu,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of Radix Angelicae Sinensis(RASI)on anti-asthma and the expressions of aquaporin-1(AQP1)and aquaporin-5(AQP5)in lung tissue of asthmatic mice with Yin deficiency syndrome.MethodsThe BALB/c mice were randomly divided into control,model,Dexamethasone,three doses of RASI,middle dose of RASI and Dexamethasone groups.Asthmatic model mouse was made by injecting ovalbumin(OVA)to sensitize,then inhaling OVA to stimulate,and thyroxin was used to make asthmatic mouse with Yin deficiency syndrome during late stimulation.The number of animals with asthma attacks,pulmonary fluid clearance,and expressions of AQP1 and AQP5 and their genes in lung tissue were observed.Results2,4 and 8 g/kg RASI could reduce the number of animals with asthma attacks,increase the ratio of W/D,and promote the expressions of AQP1 and AQP5 and their genes in lung tissue(P<0.05,P<0.01).In addition,these was a certain synergy between RASI and dexamethasone on improving the expressions of AQP1 and AQP5 and their genes(P<0.05).ConclusionsOne of mechanisms of RASI's anti-asthmatic effect is to regulate the AQP1,AQP5 proteins and their genes expression to promote water metabolism balance in lung.

【Key words】Radix Angelicae Sinensis(RASI);Asthma with Yin deficiency syndrome;Aquaporin-1;Aquaporin-5

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81460668);甘肃省自然科学基金项目(No.1310RJZA086)

通讯作者：王志旺(1970-)，男，副教授，硕士，主要从事(中药)药理与毒理学教学与研究。

〔中图分类号〕R285.5；R562.25

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)10-2309-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.001

1甘肃省中药药理与毒理学重点实验室

第一作者：李荣科(1972-)，男，副教授，硕士，主要从事中医诊治研究。