单管多重RT-PCR检测肠道病毒核酸及其临床应用

龙　辉，谢建红

(1.广东省清远市妇幼保健院　511500；2.广东省珠海市妇幼保健院　519000)

·论著·

单管多重RT-PCR检测肠道病毒核酸及其临床应用

龙辉1，谢建红2

(1.广东省清远市妇幼保健院511500；2.广东省珠海市妇幼保健院519000)

摘要:目的建立一种快速检测肠道病毒通用型(EV)、科萨奇病毒A16(CA16)和肠道病毒71(EV71)核酸的单管多重反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，并探讨其临床应用价值。方法建立单管多重RT-PCR检测EV、CA16和EV71的反应体系，并优化退火温度、各引物比例和循环参数等反应条件；采用自建RT-PCR体系检测136例手足口病患儿大便标本的肠道病毒核酸。结果单管多重RT-PCR检测体系的最佳反应条件：退火温度为54 ℃；EV、CA16和EV71引物比例为2∶1∶1；循环参数为35。采用自建单管多重RT-PCR从136例标本中检出EV阳性46例(33.82%)，CA16阳性14例(10.29%)，EV71阳性14例(10.29%)，其中CA16、EV71同时阳性2例。结论成功建立检测EV、CA16和EV71核酸的单管多重RT-PCR，并应用于手足口病患儿的病原学检测。

关键词:反转录聚合酶链反应；手足口病；肠道病毒；核酸

手足口病(HFMD)是由肠道病毒(EV)引起的常见传染病，致病病原以柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)多见[1]。以婴幼儿发病为主，近年来呈现暴发流行的趋势，严重影响婴幼儿的生活及学习，成为影响社会稳定的公共卫生问题。尤其是2008年3月在安徽阜阳暴发的手足口疫情，出现了部分死亡病例，从而引起了全社会的广泛关注[2]。如何对HFMD的病原进行快速检测，对HFMD的早期诊断、治疗和预后观察显得尤为重要。本研究旨在建立一种简便、快速检测EV核酸的单管多重反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，为HFMD的早期诊断及治疗提供病原学依据，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料收集2014年6月至2015年3月清远市妇幼保健院儿科收治的136例疑诊HFMD患儿的粪便标本，所有标本置-40 ℃保存待检。其中男74例，女62例，年龄6个月至11岁，平均3岁零2个月。HFMD参照原卫生部颁布的《HFMD诊疗指南(2010年版)》诊断标准[3]。

1.2试剂与仪器柱式病毒RNA提取试剂购自北京天恩泽基因科技有限公司，one-step RT-PCR试剂盒为Takara宝生物(大连)公司产品，采用珠海黑马9600型PCR仪进行检测。

1.3方法

1.3.1RNA提取先用生理盐水将大便标本进行重悬，取0.2 mL重悬液至1.5 mL洁净离心管中，严格按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA。提取后的RNA可直接用于RT-PCR或-80 ℃保存。

1.3.2EV通用型(以下简称EV)、CA16和EV71单重RT-PCR退火温度选择分别对EV、CA16和EV71单重RT-PCR采用梯度PCR进行退火温度摸索，温度选择47～63 ℃。采用Primer 5.0软件设计各引物序列，交由Takara宝生物(大连)公司合成，引物序列见表1。 以实时荧光RT-PCR 检测EV、CA16和EV71三者均为阳性的RNA作为RT-PCR反应的模板。RT-PCR反应条件为：50 ℃反转录反应30 min，94 ℃预变性2 min后，94 ℃ 30 s，梯度PCR退火温度47～63 ℃ 30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环后，72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR产物于2%的琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像仪对结果进行分析。

1.3.3EV、CA16和EV71单管多重RT-PCR退火温度确定在确定各单重RT-PCR退火温度后，选择EV、CA16和EV71三者均能扩增出产物的温度范围作为单管多重RT-PCR退火温度摸索条件，从而选择最佳退火温度。

表1　　EV、CA16和EV71 RT-PCR引物序列

1.3.4单管多重RT-PCR按正交设计方法摸索EV、CA16和EV71各引物比例分别以EV、CA16和EV71引物(浓度为10 μmol/L)体积0.5、1.0 、1.5和2.0 μL作为引物比例摸索条件来选择单管多重RT-PCR最佳引物比例。

1.3.5单管多重RT-PCR循环参数以25、30、35和40循环数进行单管多重RT-PCR来选择最佳循环参数。

1.3.6单管多重RT-PCR检测HFMD患儿EV核酸对单管多重RT-PCR各反应参数进行优化后，建立最佳反应体系用于临床标本检测。将136例诊断为HFMD患儿的大便标本提取RNA后，采用单管多重RT-PCR同时检测EV、CVA16和EV71，从而分析HFMD患儿EV感染情况。结果判断标准见表2。

表2　　单管多重RT-PCR检测结果解释

注：(+)表示阳性，(-)表示阴性。

2结果

2.1EV、CA16和EV71各单重RT-PCR退火温度EV在温度为47～62 ℃时均能扩增出产物，表明其退火温度范围较宽。CA16在48～54 ℃能扩增出产物，而在57～63 ℃未见扩增产物，由此说明CA16的退火温度为48～54 ℃。虽然EV71在47～62 ℃均能扩增出产物，但在47～49 ℃出现非特异性条带，说明该退火温度范围过低，因此EV71适宜的退火温度为50～62 ℃。综合三者单重RT-PCR的退火温度，选择49～55 ℃作为三者单管多重RT-PCR退火温度摸索的范围。EV、CA16和EV71单重梯度RT-PCR结果见图1。

注：EV和EV71的01～06温度范围为47～62 ℃。CA16的01～06温度范围为48～63 ℃，07为内对照，M为DNAMaker DL500。

图1EV、CVA16和EV71单重RT-PCR

各退火温度范围

2.2EV、CA16和EV71单管多重RT-PCR退火温度三者在49～55 ℃均能扩增出产物(图2)，根据三者产物条带灰度的强弱选择54 ℃作为EV、CA16和EV71单管多重RT-PCR最适退火温度。

注：01为49.4 ℃，02为50.4℃，03为51.6 ℃，04为52.9 ℃，05为54.2 ℃，06为55.0 ℃，M为DL500。

图2单管多重RT-PCR 退火温度

2.3单管多重RT-PCR EV、CA16和EV71各引物剂量见表3。 通过对各引物比例条件的摸索，根据不同引物比例产物灰度的强弱(图3)，选择EV∶CA16∶EV71=2∶1∶1为单管多重RT-PCR为最佳引物比例条件。

图3　单管多重RT-PCR EV、CA16和EV71

表3　　单管多重RT-PCR检测EV核酸引物剂量(μL)

2.4单管多重RT-PCR循环参数见图4。25循环时无扩增产物，30循环时产物条带较暗，说明产物量较少，40循环时已至PCR扩增的平台期，因此选择35循环作为单管多重RT-PCR的循环参数。

注：01为25循环参数，02为30循环参数，03为35循环参数，04为40循环参数。

图4单管多重RT-PCR不同循环参数

2.5单管多重RT-PCR检测HFMD患儿EV核酸见图5。在136例大便标本中检出EV阳性46例(33.82%)，CA16阳性14例(10.29%)，EV71阳性 14例(10.29%)，其中CA16、EV同时阳性2例。

图5　　单管多重RT-PCR检测HFMD患儿EV核酸

3讨论

HFMD是由多种人EV引起的一种婴幼儿常见的传染病，大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状，其中以EV71和CA16感染较常见[4]。特别是EV71可出现无菌性脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎等中枢神经系统病变，严重者可致死亡[5-6]。HFMD是一种可预防、可治愈的疾病，主要应于早期诊断、早期隔离、早期治疗。因而对HFMD病原学进行快速检测，为HFMD提供早期诊断依据显得尤为重要。目前HFMD诊断以临床表现为主要手段，传统的实验室诊断方法有病毒分离、中和试验和ELISA等[7]。病毒分离时间长，操作繁琐。血清中和试验和ELISA用于疾病早期诊断灵敏度不高。通过检测EV核酸则能更快速、更特异地对HFMD进行诊断[8]。常用于EV核酸检测的方法有RT-PCR和实时荧光RT-PCR等，虽然实时荧光RT-PCR检测时间短，操作简便，但由于其要使用荧光探针，且不能用单管多重的方法同时检测EV、CA16和EV71，因而检测成本较高，增加了患者的经济负担[9]。为了提高检测EV核酸的灵敏度，有研究者采用互补锁定引物技术RT-PCR和反转录环介导等温扩增法等方法来提高检测的灵敏度，但是这些方法技术难度大，应用成本更高[10-11]。为了建立一种更简便快速、经济的方法，本研究将EV、CA16和EV71 3种引物加入同一管中，对各反应条件进行优化，采用单管多重RT-PCR同时对EV、CA16和EV71进行检测。

分别对单管多重RT-PCR的退火温度、各引物的比例及循环参数等条件进行优化，其退火温度为54 ℃，EV、CA16和EV71的引物比例为2∶1∶1，循环参数为35，成功建立用于EV核酸检测的单管多重RT-PCR。并对136例HFMD患儿临床标本进行检测，EV阳性率为33.82%，CA16阳性率为10.29%，EV71阳性率为10.29%，由此表明在HFMD患儿中CA16和EV71均有感染，为HFMD的诊断、治疗及预后观察提供了指导作用。为使单管多重RT-PCR能更好地应用于临床，需要对单管多重RT-PCR进行方法学评价，包括特异性、灵敏度及与其他方法进行比较，这是本研究下一步将要解决的问题。

HFMD已在世界范围内流行，常成暴发趋势，可致严重的并发症甚至死亡，在我国已列为丙类传染病，因而实验室检查对HFMD的早期诊断有重要意义。本研究所建立的单管多重RT-PCR更能简便快速、经济有效地在各基层单位应用于HFMD的病原体检测[12]。

参考文献

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Development and application of single-tube multiplex RT-PCR for detecting enterovirus RNA

LONGHui1,XIEJianhong2

(1.MaternalandChildHealthHospitalofQingyuan,Qingyuan,Guangdong511500,China;2.MaternalandChildHealthHospitalofZhuhai,Zhuhai,Guangdong519000,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a rapid single-tube multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for rapid detection of enterovirus RNA including universal enterovirus (EV),coxsachievirus A-16 (CA16) and enterovirus 71 (EV71) and to evaluate the clinical value of this method.MethodsThe reaction conditions of single-tube multiplex RT-PCR were optimized systematically including annealing temperature,the proportion of three groups of primers and the cycle parameter.After the optimal conditions were determined,single-tube multiplex RT-PCR was used to test enterovirus RNA extracted from stool samples of 136 children diagnosed as hand-foot and mouth disease (HFMD).ResultsThe optimal reaction conditions were as follow:annealing temperature was 54 ℃,the proportion of EV,CA16 and EV71 primers corresponded to 2∶1∶1 and the cycle parameter was 35.Out of 136 samples analyzed by single-tube multiplex RT-PCR,46 samples were identified as positive for EV (33.82%),14 samples were identified as positive for CA16 (10.29%) and 14 samples were identified as positive for EV71 (10.29%),among which two samples were identified as positive for both CA16 and EV 71.ConclusionThe single-tube multiplex RT-PCR assay for detecting enterovirus RNA is successfully established and can be applied to provide etiological evidence for HFMD.

Key words:reverse transcription polymerase chain reaction;hand-foot and mouth disease;enterovirus;nucleotide

作者简介：龙辉，男，副主任技师，主要从事医学检验研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.019

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)11-1497-04

(收稿日期：2016-01-18修回日期：2016-02-25)