三种大鼠急性肺损伤模型的比较*

2016-06-24 00:48梁华平柴鉴深蔡康兴侯凤艳
成都医学院学报 2016年1期
关键词:急性肺损伤

王 婷,梁华平,柴鉴深,蔡康兴,侯凤艳,范 霞,李 羿△

1.成都医学院 药学院 (成都 610083);2. 第三军医大学大坪医院 野战外科研究所一室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室(重庆 400016)

三种大鼠急性肺损伤模型的比较*

王婷1,梁华平2,柴鉴深2,蔡康兴2,侯凤艳2,范霞2,李羿1△

1.成都医学院 药学院 (成都610083);2. 第三军医大学大坪医院 野战外科研究所一室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室(重庆400016)

【摘要】目的比较腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、气管滴注LPS和盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)诱导的3种急性肺损伤模型的差异。方法70只成年SD大鼠随机分为7组:正常组、腹腔注射LPS组(10 mg/kg,LPS-IP组)及其假手术组(SHAM-1);气管滴注LPS组(5 mg/kg, LPS-IT组)及其假手术组(SHAM-2);盲肠结扎穿刺组(CLP)及其假手术组(SHAM-3)。于造模后24 h,收集各组大鼠的动脉血用于血气分析,并通过二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白测定法、血细胞计数板以及瑞氏-姬姆萨染色分别对肺泡灌洗液中的蛋白含量、细胞总数和类别进行统计,同时利用湿干比和苏木精-伊红 (HE)染色法来评价肺组织的损伤程度。结果LPS-IT组和LPS-IP组的肺灌洗液总蛋白浓度、总细胞数均高于正常组和假手术组(P<0.05),湿干比明显增高(P<0.05),PaO2低于正常组及相应的假手术组(P<0.05);LPS-IT组和LPS-IP组肺组织有明显病理变化,包括肺水肿和肺泡壁增厚,炎性细胞浸润。CLP组未见明显改变。结论在急性肺损伤的3种大鼠模型中,LPS-IT组和LPS-IP组肺损伤较为严重,CLP组未见明显肺损伤。提示腹腔注射LPS及气管给予LPS更适用于建立急性肺损伤模型以及后续应用药物的动物实验。

【关键词】急性肺损伤;盲肠结扎穿刺;腹腔注射;气管滴注

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)由严重感染、休克、误吸等肺内外致病因素引发,临床主要表现为急性进行性加重的呼吸困难和难治性低氧血症,严重者可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress sydrome, ARDS)[1]。虽然对ALI的相关性研究已持续多年,但其发病率仍居高不下[2],病死率高达30%~40%[3]。建立可靠的动物模型对研究ALI病理改变和发病机制至关重要。ALI动物模型主要包含原发性和继发性两种。原发性ALI是向气管内注射盐酸、油酸和脂多糖等物质来直接诱导肺部损伤[4-5],而继发性ALI则是通过引发全身性疾病来诱导肺损伤,包含腹腔注射脂多糖(lipopolysacch-aride,LPS)、盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)等。在众多模型制备方法中,气管滴注LPS及腹腔注射LPS由于操作简单、观察直观而被广泛应用,而由Wechetrman等提出的CLP法因能较好地模拟脓毒症的发生发展过程也得以普遍应用。本研究针对上述3种肺损伤模型进行系统分析和比较。

1材料与方法

1.1实验动物与主要仪器

1.1.1动物健康成年SD大鼠70只,雄性,体质量(220±10) g,SPF级,购自第三军医大学大坪医院实验动物中心,动物合格证号:SYXK(渝)2012-0010。

1.1.2试剂LPS购自美国Sigma公司(0111: B4);蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;瑞氏-姬姆萨染色试剂盒购自南京建成科技有限公司;RPMI 1640细胞培养基购自美国Gibco公司。

1.1.3动物分组和模型制备将70只成年SD大鼠随机分为7组,每组10只:正常组、腹腔注射LPS(LPS-IP)组及其假手术组1(SHAM-1);气管滴注LPS(LPS-IT)组及其假手术组2(SHAM-2);盲肠结扎穿刺(CLP)组及其假手术组3(SHAM-3)。正常组不进行任何干预。LPS-IP组腹腔注射LPS溶液10 mg/kg(1 mL); SHAM-1组腹腔注射生理盐水1 mL。LPS-IT组用水合氯醛腹腔注射麻醉后(8%,1 mL),将大鼠固定,分离暴露气管,插管,经支气管缓慢滴注内毒素溶液5 mg/kg(100 μL),缝合伤口; SHAM-2组同LSP-IT组插管后,气管滴注生理盐水100 μL。CLP组使用水合氯醛腹腔注射麻醉后(8%,1 mL),将大鼠固定,消毒腹部皮肤,腹中线位置处切开,在盲肠1.2 cm处结扎,使用4号针头进行垂直穿刺,完整缝合伤口; SHAM-3组采用相同的手术方法,暴露盲肠后缝合。本实验选择的药物剂量及时间点根据参照文献[6-7]及本课题组的预实验结果确定。在造模24 h后,腹主动脉取血至死,取出完整的肺,结扎右肺,取右肺下叶测量湿干比(W/ D)。其余肺叶用于HE染色。左肺扎入24 G留滞针头,用预冷无菌生理盐水1 mL缓慢注入肺内,可见大鼠左肺逐渐变得膨隆, 缓慢回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalvage lavage fluid ,BALF), 再将所得液体缓缓注入肺内, 如此反复3次, 最后1次注入后回收灌洗液,置于10 mL的离心管中(放于冰浴中)。重复上述操作3次。

1.2检测指标与方法

1.2.1血气分析造模24 h后,经腹主动脉取血,用血气分析仪检测PaO2、PaCO2值。

1.2.2W/D取右肺下叶组织,置于干燥称量纸上称得湿重,置60 ℃恒温箱,烘烤72 h后称量干重,以W/D表示肺组织含水量。

1.2.3肺灌洗液总蛋白浓度采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白测定法。将所得BALF,于4 ℃,300×g,离心10 min, 取离心后支气管肺泡灌洗液的上清液为待测样品,加入蛋白检测试剂盒中相应试剂,可见分光光度计比色,波长570 nm,参考标准曲线得出样品蛋白质含量。每个标本均测定,取平均值即为各组动物支气管肺泡灌洗液的总蛋白含量。

1.2.4肺灌洗液总细胞数将BALF离心后的细胞团重新悬浮,并计数。每只大鼠单独计数,取平均值作为该组细胞计数总结果。

1.2.5BALF细胞组成将BALF细胞团离心,300×g离心10 min,将细胞团均匀涂抹在载玻片上,放于4%多聚甲醛固定10 min,晾干,瑞氏-姬姆萨染色,显微镜下观察不同细胞比例。中性粒细胞胞浆颗粒呈淡紫红色,细胞核多叶;肺泡巨噬细胞胞浆呈淡紫色,细胞核为完整的圆形。

1.2.6肺组织病理变化取肺组织,4%多聚甲醛固定24 h后,放入0.5%多聚甲醛保存。脱水、包埋和切片后行苏木精-伊红(HE)染色,镜下观察肺组织病理变化。

1.3统计学方法

2结果

2.1血气分析

造模后24 h,LPS-IT组和LPS-IP组PaO2低于正常组以及相应的假手术组(P<0.05),而CLP组与其余各组比较,差异无统计学意义(P>0.05),LPS-IT组与LPS-IP组比较,差异无统计学意义(P>0.05);正常组与各假手术组比较,差异也无统计学意义(P>0.05);各组间PaCO2比较,差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.2W/D

造模后24 h,与正常组及假手术组相比,LPS-IT组和LPS-IP组肺组织W/D明显增高(P<0.05),而CLP组变化不明显(P>0.05);LPS-IT组与LPS-IP组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。结果表明LPS-IT组和LPS-IP组出现明显肺水肿,但CLP组未出现此现象。

2.3肺灌洗液总蛋白浓度

LPS-IT组和LPS-IP组的肺灌洗液总蛋白浓度均高于正常组和假手术组(P<0.05),但LPS-IT组与LPS-IP组比较,差异无统计学意义(P>0.05);CLP组、正常组和假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05);CLP组的蛋白浓度明显低于LPS-IP组和LPS-IT组(表1),其中与LPS-IP组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4肺灌洗液总细胞数

除CLP组外,来源于LPS-IT组和LPS-IP组中的肺灌洗液总细胞数均高于正常组和假手术组(P<0.05),LPS-IT组和LPS-IP组比较,差异无统计学意义(P>0.05),CLP组、正常组和假手术组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.5BALF细胞瑞氏-姬姆萨染色

LPS-IT组和LPS-IP组出现中性粒细胞浸润,且比例大于细胞总数的80%;各假手术组及 CLP组未出现中性粒细胞浸润(图1)。

表1 不同模型肺损伤指标比较

注:1 mm Hg=0.133 KPa;与自身假手术组比较,aP<0.05;与正常组比较,bP<0.05;与LPS-IT组比较,cP<0.05;与LPS-IP组比较,dP<0.05

图1肺泡灌洗液中细胞的瑞氏-姬姆萨染色(×200)

注:A:SHAM-1组;B:SHAM-2组;C:SHAM-3组;D:LPS-IT 组;E:LPS-IP组;F:CLP组

2.6HE染色

各假手术组肺泡结构完整,无损伤表现;LPS-IT组和LPS-IP组出现肺间质水肿、肺泡结构紊乱和肺泡壁变厚等病理学改变;CLP组未见明显病理学改变(图2)。

图2光镜下观察不同模型组的组织病理学变化(×100)

注:A:SHAM-1组;B:SHAM-2组;C:SHAM-3组;D:LPS-IT 组;E:LPS-IP组;F:CLP组

3讨论

急性肺损伤动物模型是研究ALI/ARDS发病机制及有效疗法的重要实验手段。本研究所讨论的腹腔注射LPS、气管滴注LPS以及CLP 3种急性肺损伤模型均是典型的原发性或继发性急性肺损伤模型。它们分别具有各自的优势:LPS-IP模型的实验操作简单稳定,动物无需进行麻醉或有创操作,并且LPS经腹腔注射后会随血流均匀分布于脏器中,因此脏器相同部位具有较强的可比性,可减少实验误差,节约标本[8];LPS经气管直接注入肺部后,会使得局部炎症反应加剧,造成更加严重的局部损伤,组间差异明显[9];CLP因能较好地模拟人类脓毒症发病过程而被视作脓毒症动物模型的“金标准”,并被广泛应用于急性肺损伤等脓毒症相关并发症的研究[10-11]。

评价一个动物模型是否合格主要取决于它是否能较好地模拟该疾病的发生、发展过程,包括组织病理学和生理学变化[12]。ALI/ARDS的主要病理学特征表现为上皮细胞损伤、中性粒细胞等炎性细胞浸润和渗透性肺水肿的形成[13]。本研究LPS-IT组和LPS-IP 组W/D、肺灌洗液总蛋白浓度和细胞总数均明显增加,通过HE染色发现两组肺脏组织结构出现明显异常,表现为不同程度的肺泡壁增厚、肺泡间隔加宽、肺泡结构遭到严重的破坏(图2),但是CLP 组仅观察到肺泡灌洗液中含有巨噬细胞。由此可见,气管滴注或腹腔注射LPS 均可造成上皮细胞损伤、肺水肿以及以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润,表明这两种模型均能成功模拟ALI的病理学特征。在功能性指标方面,血气分析发现,仅LPS-IT组和LPS-IP组的PaO2与正常组相比有所降低,其余指标均正常,这有可能是机体代偿效应所致。

本研究意外发现,LPS-IT组与LPS-IP组所造成的肺部损伤程度并无明显差异,且CLP 组未出现明显肺损伤。CLP组实验结果与Iskander等[14]的结果相似,Iskander等检测了CLP后肺平均动脉压等多个相关指标,明确提出CLP模型不能造成动物ALI。结合本课题组的实验,分析出现上述现象的原因可能为:1)观察点的选取。文献报道,气管滴注LPS诱导的肺损伤模型,肺泡灌洗液中中性粒细胞数量在造模后24~96 h都维持在较高水平,随后恢复正常[13]。而通过LPS间接引发肺损伤模型出现明显炎性细胞浸润是在损伤后24 h[12]。因此,本研究选取24 h作为模型最后终止时间,但LPS-IT组、LPS-IP组和CLP组出现肺损伤的高峰期并非都是24 h,尤其对于CLP模型,肺损伤的高峰期可能出现在48 h以后[15-17]。2)造模方式。在急性肺损伤模型建立过程中,CLP通常不单独引发肺损伤,而是通过联合免疫复合物、失血性休克[17]等措施造成小鼠二次打击来促使肺损伤的发生[18]。3)严重程度差异。由于盲肠结扎长度以及穿孔大小均会影响CLP的严重程度,进而影响急性肺损伤等并发症的发生率[17,19]。

综上所述,针对24 h这一时间节点,腹腔注射LPS以及气管滴注LPS均能较好地模拟急性肺损伤的发病过程,而在本课题组实验条件下CLP却不能很好模拟上述过程。表明腹腔注射LPS以及气管滴注LPS更适合用于急性肺损伤模型的建立。

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Comparison of Three Rats′ Models of Acute Lung Injury

WangTing1,LiangHuaping2,ChaiJianshen2,CaiKangxing2,HouFengyan2,FanXia2,LiYi1△.

1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China;2.StateKeyLaboratoryofTrauma,BurnsandCombinedInjury,ResearchInstituteofSurgery,DapingHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China

【Abstract】ObjectiveTo compare the difference among three models of acute lung injury induced by intraperitoneal injections with Lipopolysaccharide(LPS), intratracheal instillation with LPS and cecal ligation and puncture(CLP). Methods70 adult SD rats were randomly divided into 7 groups i.e. normal group; sham group 1, secondary ALI group (LPS-IP group, intraperitoneal injection of 10 mg/kg of LPS); sham surgery group 2, primary ALI group (LPS-IT group, intratracheal instillation 5 mg/kg of LPS); sham group 3, cecal ligation and puncture group (CLP group). 24 hours after operation, arterial blood, lung lavage, lung tissue were collected and rat′s blood, wetmassto dry mass ratio, lung lavage fluid protein content, cell count and cell grouping were detected via BCA protein assay, blood cell count plate and Wright′s Giemsa staining, respectively. Pathological changes in lung tissues were evaluated with hematoxylin-eosin staining. ResultsCompared with normal group, the pulmonary edema and pulmonary permeability of LPS-IT and LPS-IP groups were higher, protein content and total cell volume were increased and neutrophil infiltration was obviously more severe in lung lavage(P<0.05). Meanwhile, PaO2 was significantly lower than the normal group and the corresponding sham surgery group (P<0.05). There were obvious pathological changes in lung, including edema and thickening of alveolar walls, infiltration of inflammatory cells, and obvious bleeding in the local lung tissue. No obvious lung damage appeared in CLP group. Conclusion Both intraperitoneal injection and intratracheal instillation of LPS can induce obvious lung injury, and the latter can cause more severe lung injury while CLP did not cause obvious lung damage. Intraperitoneal injection and intratracheal instillation of LPS are more suitable for establish acute lung injury models and the following animal experiments using drugs.

【Key words】Acute lung injury;Cecal ligation and puncture;Intraperitoneal injection;Intratracheal instillation

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.01.002

*基金项目:国家重点基础研究发展计划973项目(No:2012CB518102); 军队“十二五”重点项目(No:BWS11J038)

通信作者:△李羿,E-mail:lychengdu@aliyun.com

【中图分类号】R363.2

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160301.0944.008.html

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