一株嗜热链球菌产多糖条件的优化

任　玮，　夏永军，　王光强，　张　汇，　熊智强，　艾连中

上海理工大学医疗器械与食品学院， 上海 200093

一株嗜热链球菌产多糖条件的优化

任玮，夏永军，王光强，张汇，熊智强，艾连中*

上海理工大学医疗器械与食品学院， 上海 200093

摘要：使用单因素和正交试验设计相结合的方法对培养基配方及培养条件进行优化提高嗜热链球菌AR333的胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)产量。获得最佳培养基配方为：脱脂乳粉15% (w/v)、半乳糖1% (w/v)、大豆蛋白胨0.5% (w/v)、磷酸氢二钾0.1% (w/v)。最佳培养条件为：接种量3%，40 ℃，初始pH 6.5，发酵时间16 h。优化后嗜热链球菌AR333的EPS产量可达256.97 mg/L，比优化前的产量提高了3.6倍。

关键词：嗜热链球菌； 胞外多糖； 优化

胞外多糖(exopolysaccharides, EPS):由一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、分泌到环境中的水溶性多糖[1]。嗜热链球菌属于乳酸菌(LAB)，是食品级工业生产菌，其分泌的EPS在乳制品行业被公认绿色、安全，可以直接被应用到发酵食品中，节约工业成本[2-4]。不同嗜热链球菌生产EPS的最佳发酵条件差异很大[5,6]。因此不同菌株产多糖的条件需要进行具体探究。本实验室已筛选出一株产活性黏多糖的嗜热链球菌AR333，经研究发现其所产EPS有利于改善发酵食品的粘度和质地且具有免疫活性，在食品工业中具有潜在的开发价值。对AR333的产多糖条件进行必要的优化措施能够最大化获得自身所要得到的目标产物，节约生产成本。影响EPS合成的因素很多，除了产生菌的遗传特性、自身产生的能量外，还有环境因素，如培养基成分(碳源、氮源、无机盐等)、培养基初始pH值、发酵温度和时间、接菌量等等[4, 5]。初步优化这些条件,以达到提高其EPS产量的目的。

1材料和方法

1.1菌种、试剂及培养基

嗜热链球菌AR333由实验室保藏。脱脂乳粉购自光明乳业股份有限公司，其他试剂均为分析纯。脱脂乳培养基(基础培养基)：脱脂奶粉15%(w/v)，115 ℃下灭菌20 min；最佳配方培养基(w/v)：脱脂乳粉15%、半乳糖1%、大豆蛋白胨1%、磷酸氢二钾0.1%。

1.2方法

1.2.1种子液制备

挑取嗜热链球菌AR333单菌落接种入1 mL的基础培养基，40 ℃下培养10 h作为种子液。

1.2.2发酵液中EPS含量测定

发酵液10 000 r/min，4 ℃下离心20 min，上清部分加80%的三氯乙酸溶液至终浓度4%，4 ℃静置过夜后10 000 r/min离心20 min，上清液常温透析72 h (每6 h换一次去离子水)[3]，然后测定EPS含量，以无菌培养液为空白对照。由于AR333所产EPS主要成分为半乳糖，因此苯酚硫酸法[7]测定EPS含量时采用半乳糖标准曲线。

1.2.3添加不同营养成分对EPS产量的影响

发酵初始条件：基础培养基，接种量2%(v/v)，37 ℃下培养24 h。

在基础培养基中分别添加1.0 %与0.1 %的不同碳源(葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖)，种子液为活化两代的AR333，接种量3% (v/v)，置40 ℃下培养16 h后测定发酵液中EPS含量。

在最优碳源培养基中分别添加1.0%与0.1%的不同氮源(尿素、柠檬酸铵、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨)，接种量3%，其他条件同上，测定发酵液中EPS含量。

高温灭菌时高浓度无机盐容易造成脱脂乳凝结，根据预实验结果选择0.1%作为初始添加量。在最优碳氮源培养基中分别添加0.1%的柠檬酸氢二胺、磷酸氢二钾、醋酸钠、硫酸镁、氯化钠。接种量3%，其他条件同上，测定发酵液中EPS含量。

1.2.4通过正交试验确定最佳培养基配方

根据单因素试验结果，选择显著影响菌体生长和EPS产量的碳源、氮源、无机盐为正交试验的3个影响因素，每个因素在试验范围内取3个水平(表1)。以发酵液中EPS含量为试验指标，确定最佳培养基配方。正交表采用L9(34)。

表1　正交试验设计(L9(34))

1.2.5发酵条件优化

在确定最佳培养基配方的基础上，对AR333产EPS的发酵条件(接种量、发酵温度、初始pH、发酵时间)进行优化。

接种量优化：活化两代的AR333分别以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的接种量接入最佳配方培养基(20 mL)中，40 ℃下培养16 h后测定发酵液中EPS含量。

发酵温度优化：接种量3%，发酵温度选择37 ℃、40 ℃和42 ℃。

发酵初始pH优化：接种量3%，40 ℃，初始pH选择5.5、6.5、7.5。

发酵时间优化：在优化条件下，20 h内每隔4 h取样测定发酵液pH与EPS含量，确定最适发酵时间。

2结果与讨论

2.1添加不同营养成分对菌株AR333产EPS的影响

嗜热链球菌常被用作为乳品发酵剂[8-10]。文献报道数据显示，嗜热链球菌的多糖产量可以超过50 mg/L[11]。目前菌株AR333的初始EPS产量即可达到71.16 mg/L，有必要采取优化措施进一步提高其EPS产量，为该菌株开发利用奠定基础。从原料成本角度考虑，选用配方简单的脱脂奶粉培养基作为基础培养基。

2.1.1添加不同碳源对菌株AR333产EPS的影响

如表2所示，同基础培养基相比，添加1.0%的葡萄糖，半乳糖，蔗糖后AR333的EPS产量有显著的升高。其中，添加半乳糖时EPS产量最高，因此选择半乳糖为最佳碳源。

表2　添加不同营养成分对EPS产量的影响

EPS的生物合成途径是在细胞浆内通过糖基转移酶将被激活的单糖从糖基-核苷酸上顺序性地转移而装配到细胞膜内侧的类异戊二烯脂质载体上，合成多糖的结构重复单元；随后多糖重复单元通过脂质载体的运载作用穿过细胞膜至细胞表面；最后在聚合酶的作用下，几百或数千个多糖结构重复单元聚合形成多糖[12-14]。添加半乳糖效果显著的原因可能是AR333能够直接将半乳糖吸收并激活进行装配工作，从而提高了EPS的产量[12]。

2.1.2添加不同氮源对菌株AR333产EPS的影响

在添加1%半乳糖的基本培养基中继续添加1.0%的尿素、胰蛋白胨、酪蛋白胨和大豆蛋白胨，EPS产量继续提升(表2)，说明添加这4种氮源有利于提高菌株AR333的多糖产量。其中，添加大豆蛋白胨时EPS产量最高，所以选择大豆蛋白胨为最佳氮源。

2.1.3添加不同无机盐对菌株AR333产EPS的影响

同未添加无机盐的培养基配方比较，添加了0.1%的柠檬酸氢二胺，磷酸氢二钾后EPS产量显著升高，说明这两种无机盐在低浓度时适于嗜热链球菌AR333的利用。添加醋酸钠后EPS含量为(200.48±8.67)mg/L，比不添加时的(214.83±4.68)mg/L还低，可能此种浓度的醋酸钠不利于AR333产多糖。添加0.1%的磷酸氢二钾对EPS产量提升效果最为显著，因此选择以磷酸氢二钾为最佳无机盐。

2.2正交试验

正交试验设计具有优良的均衡分散性和整齐可比性，设计的试验点具有强烈的代表性，根据设计各因素的主次顺序以及对实验指标的影响规律，往往能以较少的试验次数，筛选出满意的结果。从而提高实验效率和分析质量[15]。经过单因素实验，选择了半乳糖、大豆蛋白胨、磷酸氢二钾三因素设计正交试验，结果如表3和图1所示。根据极差R值可知，大豆蛋白胨是影响EPS产量最重要的因素，半乳糖次之，磷酸氢二钾影响最小。此三因素最适水平分别为半乳糖添加量1.0%，大豆蛋白胨1.0%，磷酸氢二钾0.1%。

2.3培养条件对菌株AR333产EPS的影响

2.3.1接种量对EPS产量的影响

表3　嗜热链球菌培养条件正交试验结果

图1　正交实验水平趋势图

不同接种量对EPS产量的影响见表4。从表中可以看出，最佳接种量为3%。

表4　不同接种量对嗜热链球菌AR333 EPS

2.3.2发酵温度对EPS产量的影响

发酵温度不同，菌株的生长及其合成EPS的产量亦明显不同。一般菌体浓度与合成EPS的产量成正相关[16]。发酵温度过低，菌体生长缓慢，从而影响EPS的合成。发酵温度过高，培养后期容易发生自溶，也会影响EPS的产量。

不同发酵温度下EPS产量见表5。从表中可以看出，EPS产量在40 ℃时达到最大，低于菌体最适生长温度42 ℃。这与前人的研究发现相符合，即发酵温度低于最适生长温度时，有利于嗜热链球菌EPS的形成。较低温度下，菌体生长速度也较慢，因此细胞壁的合成速度也减慢，从而使较多的磷酸异戊二烯被菌体用于合成EPS[17]。

表5　不同温度对嗜热链球菌AR333 EPS

2.3.3不同初始pH对EPS产量的影响

不同pH条件下菌株AR333产EPS的情况见表6。数据显示产EPS的最佳初始pH为6.5。研究表明，在接近中性偏酸的pH条件下，EPS生物合成量较大[4-6, 12, 16, 18]。目前己证实，参与EPS生物合成的类异戊二烯脂质载体的运载最适pH值在6.5～7.0，pH值的降低会因失去脂质载体中间体而使EPS合成受阻[19]。尽管培养过程中通过控制体系pH可以显著提升EPS的产量，但从生产发酵乳制品的角度来讲，却是一个难以实现的限制性因素[4]。

表6　不同初始pH对嗜热链球菌AR333 EPS

2.3.4最佳条件下菌株的产多糖曲线

初始和最佳发酵条件下EPS产量随发酵时间变化趋势见图2。从图中可以看出，EPS的最大产量出现在16 h附近。时间延长，EPS产量不再继续提升，原因可能是多糖逐渐开始水解[4, 20]。因此最佳发酵时间选择16 h。

2.3.5优化前后AR333 EPS产量比较

在优化后的最佳培养条件下培养16 h，菌株AR333的EPS产量可以提升到256.97 mg/L，比优化前的产量(71.16 mg/L)提高了3.6倍。

图2　嗜热链球菌AR333的产多糖曲线与产酸曲线

3结论

(1) 可知碳源、氮源、与无机盐种类的选择均会对嗜热链球菌AR333的EPS合成产生明显影响。通过单因素实验确定最佳碳源、最佳氮源和最佳无机盐分别为半乳糖、大豆蛋白胨和磷酸氢二钾。

(2) 由正交实验可知大豆蛋白胨的添加量对菌株AR333 EPS产量的影响最大，半乳糖次之，无机盐影响最小。最佳培养基配方为半乳糖1%、大豆蛋白胨1%、磷酸氢二钾0.1%。

(3) 使用最佳培养基配方培养菌株AR333产PES，通过单因素实验找到最佳培养条件为接种量3%，40 ℃，初始pH 6.5，培养时间16 h。

(4) 在优化后的条件下，菌株AR333的EPS最高产量可达256.97 mg/L，比优化前(接种量2%，37 ℃，自然pH，发酵时间24 h)的产量提高了3.6倍，成功实现了优化培养基和培养条件的目的，为后续AR333多糖制备与研究奠定了基础，对工业化利用嗜热链球菌菌株发酵生产EPS起到一定的指导作用。

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Culture condition optimization ofStreptococcusthermophilesAR333 for exopolysaccharides production

REN Wei, XIA Yong-jun, WANG Guang-qiang, ZHANG Hui, XIONG Zhi-qiang, AI Lian-zhong

School of Medical Instrument and Food Engnieering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China

AbstractThe medium composition and fermentation conditions were optimized by using the single factor analysis method and the orthogonal experiment to elevate the exopolysaccharides (EPS) production of Streptococcus thermophiles AR333. The optimal composition of the medium: dried skim milk 15%, galactose 1%, soy peptone 1% and K2HPO4 0.1%. The optimal fermentation conditions were as follows: 40 ℃, inoculum size 3%, initial pH 6.5 and fermentation time 16 h. The yield of EPS produced by Streptococcus thermophiles AR333 under the optimal conditions reached 256.97 mg/L, which was 3.6-fold of that before optimization.

Key wordsStreptococcus thermophiles; exopolysaccharides; fermentation condition optimization

doi:10.3969/j.issn.1001-6678.2016.02.004

基金项目：国家自然科学基金面上项目(No.31371809)；国家自然科学基金-青年科学基金项目(No.31401670)；新世纪优秀人才计划(NCET-13-0901)。

作者简介：任玮(1990～)，女，硕士研究生，研究方向：微生物方向。E-mail:595824301@qq.com。 *通讯作者：艾连中，男，教授。E-mail:ailianzhong@163.com。