合欢花总黄酮含量的测定及其超声提取工艺研究

蔡晓琴， 顾霞敏， 唐小琴， 金 倩， 詹艳丽

(台州学院医药化工学院，浙江台州 318000)

合欢花总黄酮含量的测定及其超声提取工艺研究

蔡晓琴， 顾霞敏*， 唐小琴， 金 倩， 詹艳丽

(台州学院医药化工学院，浙江台州 318000)

摘要[目的]提取并测定合欢花中总黄酮。[方法]采用AlCl3-甲醇显色-紫外分光光度法测定合欢花中总黄酮的含量，并以总黄酮提取率为指标，通过正交试验优化合欢花中黄酮类化合物的超声提取工艺。[结果]确定紫外检测波长为434 nm，精密度、重复性的RSD分别为0.96%、1.46%，加样回收率为99.6%。超声提取最佳工艺参数为料液比1∶30(g∶mL)、乙醇体积分数80%、温度60 ℃、提取2次，在此条件下总黄酮提取率为2.94%。[结论]该方法可为进一步开发合欢花资源提供一定的参考。

关键词合欢花；总黄酮；测定；超声提取法；工艺

合欢花为豆科植物合欢(Albiziajulibrissindurazz)的干燥花序或花蕾，主要含有挥发性成分[1]、多糖[2]和黄酮类化合物[3]等。研究发现，合欢花黄酮类化合物具有抗抑郁、抗焦虑等作用[4-5]，合欢花为一些治疗抑郁症方剂中的主药。目前，关于合欢花总黄酮的提取和含量测定研究较少。国内外研究主要采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[6]和AlCl3-甲醇显色法[7-8]2种紫外分光光度法测定总黄酮的含量，前者需要依次加入3种试剂，显色时间共为27 min；而后者加入1种试剂，显色时间为15 min，可见AlCl3-甲醇显色法更简便。该试验采用AlCl3-甲醇显色-紫外分光光度法测定合欢花中总黄酮的含量，并以总黄酮提取率为指标，通过正交试验优化合欢花中黄酮类化合物的超声提取工艺，为合欢花资源的充分利用提供一定的依据。

1材料与方法

1.1试材合欢花，购自浙江省椒江市阜大药店；芦丁标准品(批号100080-201409；来自中国药品食品检定研究院)；甲醇、乙醇、石油醚(60～90 ℃)、AlCl3·6H2O，均为分析纯。

1.2仪器UV-2401PC岛津紫外分光光度计(日本岛津公司)，FW177中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，JN-3200DT型超声波清洗机(宁波江南仪器厂)，SHZ-ⅢB型循环水式多用真空泵(巩义予华仪器有限责任公司)。

1.3方法

1.3.1溶液的配制。

1.3.1.1芦丁标准溶液的制备。精密称取芦丁10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即为1 mg/mL的芦丁标准溶液。

1.3.1.2样品溶液的制备。合欢花干燥、粉碎，过60目筛子。取1.0 g合欢花粉末于具塞锥形瓶中，加入60%乙醇30 mL，60 ℃下超声提取40 min。抽滤，滤液用石油醚萃取，取下层液体，减压浓缩至浸膏状，用甲醇溶解并定容至25 mL。

1.3.2检测波长的确定。分别移取1 mL的芦丁标准溶液和样品溶液于10 mL容量瓶中，加入1%AlCl3-甲醇溶液4 mL，用甲醇稀释至刻度[8]，摇匀、显色15 min。同法以甲醇制得空白溶液，在200～600 nm波长范围内进行扫描。根据吸收谱图，确定最佳显色波长。

1.3.3方法学考察。

1.3.3.1线性关系的考察。将芦丁标准溶液用甲醇稀释成浓度为0.004～0.100 mg/mL的系列浓度标准溶液。同“1.3.2”进行显色，在确定的检测波长下，用紫外分光光度计测定吸光度。以标准液浓度(X)为横坐标、吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3.2精密度试验。取“1.3.1.2”制备的样品溶液6份，分别进行显色，测定吸光度，计算RSD。

1.3.3.3稳定性试验。取1 mL样品溶液，显色15 min后，分别测定0～40 min(间隔2 min)内吸光度的变化并计算RSD。

1.3.3.4重复性试验。取合欢花粉末6份，按照“1.3.1.2”的方法制备样品溶液，分别取样分析，测定吸光度，计算RSD。

1.3.3.5加样回收率试验。取5份同一样品溶液各1 mL，分别加入0.02 mg/mL的芦丁标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别测定加样前后吸光度变化，计算溶液中总黄酮的含量、加样回收率和RSD。

1.3.4合欢花总黄酮提取工艺的优化。

1.3.4.1正交试验。参考文献[9-10]和根据前期试验，以乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取温度(C)进行三因素三水平正交试验(表1)，优化合欢花总黄酮提取工艺。具体操作为：称取1.0 g合欢花粉末于具塞锥形瓶中，根据因素水平表(表1)，加入一定量的试剂，超声提取40 min。提取液用石油醚萃取，取下层液体，减压浓缩除去溶剂，用甲醇溶解并定容至25 mL，即为提取液。以提取率为指标，确定提取的乙醇体积分数、料液比和提取温度。

表1　正交因素水平

1.3.4.2提取次数的考察。在正交试验确定的工艺条件下，提取1、2、3、4、5次，计算合欢花中总黄酮的提取率，确定最佳提取次数。

2结果与分析

2.1合欢花总黄酮含量的测定

2.1.1检测波长的选择。由图1可知，样品溶液与标准溶液在210、273和434 nm 处有吸收峰。由于434 nm干扰较小，因此确定检测波长为434 nm。

注：1为芦丁标准溶液；2为样品溶液。Note: 1. Rutin standard solution; 2. Sample solution. 图1 芦丁与样品溶液吸收谱图Fig. 1　Absorption spectra of rutin and sample solution

2.1.2线性关系的考察。按“1.3.3.1”方法操作，以芦丁标准液浓度(X)为横坐标、吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，计算得回归方程为Y=3.445 6X-0.011 7(R2=0.997 3)，说明该方法在芦丁浓度0.004～0.100 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3精密度试验。按“1.3.3.2”方法操作，测定6份样品平行溶液的吸光度，计算得RSD=0.96%，表明该方法精密度良好。

2.1.4稳定性试验。按“1.3.3.3”方法操作，计算30 min吸光度RSD为0.70%，40 min内RSD为1.04%，表明该显色方法至少在40 min内是稳定的。

2.1.5重复性试验。按“1.3.3.4”方法操作，计算得平均提取率为2.49%，RSD=1.46%(n=6)，说明该方法重复性良好。

2.1.6加样回收率试验。按“1.3.3.5”方法操作，计算得加样回收率为98.3%～101.0%，平均回收率为99.6%，RSD=1.31%，满足分析测定的需要。

2.2合欢花总黄酮超声提取工艺的优化

2.2.1正交试验。以乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取温度(C)进行正交试验，平行操作3次。由表2可知，影响合欢花总黄酮提取的主次顺序依次为乙醇体积分数(A)、提取温度(C)、料液比(B)；最佳方案为A3B1C3，即乙醇体积分数80%、料液比1∶30(g∶mL)、提取温度60 ℃，为正交试验中第7组试验，平均提取率为2.85%，高于其他8组试验，证明该条件为最佳选择。

表2　正交试验结果

2.2.2提取次数的确定。在“2.2.1”的最佳条件下，提取1～5次。由图2可知，增加提取次数可以增加提取率，但提取2次后，随着提取次数的增加，提取率的增加幅度不大，从经济效益考虑，确定提取次数为2次，相应提取率为2.94%。

图2　提取次数对总黄酮提取率的影响Fig.2　Effects of extraction times on the extraction rate of total flavonoids

3结论

该研究采用AlCl3-甲醇显色-紫外分光光度法测定合欢花中总黄酮的含量，并以总黄酮提取率为指标，通过正交试验优化合欢花中黄酮类化合物的超声提取工艺。结果表明，确定紫外检测波长为434 nm，精密度、重复性的RSD分别为0.96%、1.46%，加样回收率为99.6%。合欢花总黄酮超声提取最佳工艺参数为料液比1∶30(g∶mL)、乙醇体积分数80%、温度60 ℃、提取2次，在此条件下总黄酮提取率为2.94%。该方法简单、快速、准确，适合于合欢花总黄酮含量的测定，可为进一步开发合欢花资源提供一定的参考。

参考文献

[1] 李超, 郑瑶青, 孙亦栋, 等. 合欢花的挥发性成分[J]. 分析化学, 1988, 16(7): 585.

[2] 袁建梅, 吕馨馨, 王春峰. 合欢花多糖的提取及其抗氧化活性研究[J]. 湖北农业科学, 2013, 52(11): 2625-2628.

[3] 耿红梅. 合欢花黄酮类化学成分的研究[J]. 衡水学院学报, 2011, 13(1): 28-29.

[4] 刘倩佟, 刘洁, 郭建友, 等. 合欢花总黄酮抗焦虑作用研究[J]. 现代中药研究与实践, 2015, 29(2): 33-35.

[5] 郭超峰, 夏猛, 银胜高, 等. 合欢花总黄酮的抗抑郁作用及其机制研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013, 19(13): 225-228.

[6] 刘莹, 赵杰. 接骨木茎总黄酮的提取条件研究[J]. 应用化工, 2012, 41(1): 113-115.

[7] 顾霞敏, 许海丹, 梁丹霞. 马兰叶总黄酮的提取及其含量的测定[J]. 应用化工, 2014, 43(2): 281-283.

[8] 顾霞敏, 许海丹. 聚酰胺吸附-铝离子显色法测定乌药叶中总黄酮的含量[J]. 时珍国医国药, 2009, 20(1): 196-197.

[9] 张云云, 顾霞敏, 胡佳利, 等. 表面活性剂协同超声波提取合欢花中黄酮类化合物[J]. 食品与发酵科技, 2015, 51(4): 30-33.

[10] 梁丹霞, 顾霞敏, 许海丹. 合欢花总黄酮不同提取工艺的比较[J]. 食品与发酵科技, 2015, 51(5): 23-26.

Determination and Ultrasonic Extraction of Total Flavonoids from the Flowers ofAlbiziajulibrissindurazz

CAI Xiao-qin, GU Xia-min*, TANG Xiao-qin et al

(School of Pharmaceutical and Chemical Engineering, Taizhou University, Taizhou, Zhejiang 318000)

Abstract[Objective] To extract and detect the total flavonoids from the flowers of Albizia julibrissin durazz. [Method] The content of total flavonoids in A. julibrissin was determined by AlCl3-methanol color development-UV spectrophotometry. With the extraction rate of total flavonoids as the index, ultrasonic extraction technology of flavonoids from A. julibrissin was optimized by orthogonal test. [Result] The detection wavelength was 434 nm. The RSDs of precision and reproducibility tests were 0.96% and 1.46%, respectively. The average recovery rate was 99.6%. The optimal extraction technology was 1∶30(g∶mL) solid-liquid ratio, 80% ethanol volume fraction, 60 ℃ extraction temperature and 2 extraction times. Under this condition, the extraction rate of total flavonoids from the flowers of A. julibrissin was 2.94%. [Conclusion] This research provides references for the further development of A. julibrissin flowers.

Key wordsFlowers of Albizia julibrissin durazz; Total flavonoids; Determination; Ultrasonic extraction; Technology

基金项目台州学院校立青年基金项目(2013QN18)。

作者简介蔡晓琴(1995- )，女，浙江建德人，本科生，专业：制药工程。*通讯作者，讲师，硕士，从事天然产物的提取与分析研究。

收稿日期2016-03-08

中图分类号S 509.9;R 284.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-151-03