家蚕微孢子虫与其他蚕病病原的联合感染试验

黄旭华，潘志新，黄深惠，王霞，唐亮，安春梅，胡文娟

（广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007）

家蚕微孢子虫与其他蚕病病原的联合感染试验

黄旭华，潘志新，黄深惠，王霞，唐亮，安春梅，胡文娟

（广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007）

调查家蚕微孢子虫（Nosema bomycis，简称Nb）分别与家蚕核型多角体病毒（BmNPV）、家蚕质型多角体病毒（BmCPV）、家蚕肠道菌、苏芸金杆菌（Bt）和家蚕白僵菌联合感染家蚕时存在的拮抗情况。结果显示家蚕感染适量Nb后，再以其它病原感染家蚕，都具有一定的降低家蚕微粒子病发生效果，其中以Nb感染家蚕后再感染BmNPV 或BmCPV的抑制效果较明显，但其他病原或其他感染方式对降低家蚕微粒子病发生的效果不明显。

家蚕微孢子虫；蚕病病原；交叉感染；拮抗作用

在微生物界，两种微生物间具有拮抗或增效作用是常见的现象，如常见研究报道一些芽孢杆菌可以分泌一些抗菌物质抑杀其他细菌或真菌病原[1]。在蚕业界，也有些学者调查家蚕病原间的拮抗效果，如鲁兴萌等[2]的研究表明家蚕肠球菌对微孢子虫体外发芽有明显的抑制作用；肖仕全等[3]研究4种家蚕病原微生物（CPV、NPV、Nb、SCM6）交叉感染家蚕的致病力变化情况，发现Nb与CPV、SCM6交叉感染具有死亡率降低现象；刘广生等[4]调查苏云金杆菌与核型多角体病毒联合致病的效果，发现Bt和BmNPV可以互相增强毒力的效果。家蚕微粒子病是一种危害性极大的蚕病，该病具有食下传染和胚种传染两种传染方式，是蚕种生产唯一的法定检疫对象，家蚕微粒子病的防治是蚕业生产的关键问题之一。家蚕微孢子虫（Nosema bomycis，简称Nb）是家蚕微粒子病的典型病原，在蚕体内Nb与其他病原的拮抗作用如何，本文进行一些初步研究。

1 材料与方法

1.1 蚕品种

932×芙蓉（由广西壮族自治区蚕业技术推广总站提供）。

1.2 病原

家蚕微孢子虫（Nosema bomycis，简称Nb）、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）、家蚕质型多角体病毒（BmCPV）、苏芸金杆菌（Bt）、家蚕肠道菌和白僵菌均由广西蚕业技术推广总站蚕病研究室提供。Nb、BmNPV和BmCPV接种蚕体复壮、纯化；Bt和肠道菌接种于LB固体培养基，于37℃培养12 h，用接种环挑取单菌落溶于无菌水配成菌体悬浮液；白僵菌接种于PDA固体培养基，于25℃培养72 h，利用无菌水把菌苔刮下，过滤，配成菌体原液。将各种试验病原制成水玻片，在光学显微镜（×600）下观察各种病原的形状、大小等，用血球计数板测定各种病原悬浮液的浓度。

1.3 各种病原感染力测定

1.3.1 Nb半数感染浓度（IC50）测定 将家蚕微孢子虫（Nb）孢子液稀释成107～103个/ mL的10倍系列稀释液，分别取各级浓度的微孢子虫孢子液0.4 mL，涂抹于3张面积为12 cm2的桑叶上，饲喂1小区（30头）2龄起蚕，重复3小区。待蚕儿吃净带毒叶后，改饲正常无毒桑叶，饲养至5龄起蚕，放置1d后对试验区的每一头蚕逐一研磨镜检，调查感染率。采用Reed-Muench法计算出其半数感染浓度（IC50）[5]。

1.3.2 BmNPV半数致死浓度（LC50）测定 攻毒方式同1.3.1，调查方式是添毒96 h后调查发病蚕头数，连续调查4 d。采用Reed-Muench法计算出其半数致死浓度（LC50）。

1.3.3 BmCPV半数致死浓度（LC50）测定 攻毒方式同1.3.1，调查方式是添毒240 h后，逐头研磨镜检，观察是否有四角形多角体，调查发病蚕头数。采用Reed-Muench法计算出其半数致死浓度（LC50）。

1.3.4 Bt 半数致死浓度（LC50）测定 攻毒方式同1.3.1，调查方式是添食病原后，即逐日调查卒倒病毙死病蚕头数。采用Reed-Muench法计算出其半数致死浓度（LC50）。

1.3.5 肠道菌半数感染浓度（IC50）测定 将家蚕肠道菌液稀释成109～107个/ mL的10倍系列稀释液，攻毒方式同1.3.1，调查方式是添食病原24 h后，即观察蚕儿发育情况，记录毙死病蚕头数。

1.3.6 白僵菌半数致死浓度（LC50）测定 采取浸叶片添食法进行攻毒，操作方式同1.3.1，饲养温度25±1℃，相对湿度90%。连续观察14 d，并统计各处理的家蚕14 d累计死亡率及白僵蚕率。采用Reed-Muench法计算出其半数致死浓度（LC50）。

1.4 各种病原与Nb交叉感染试验

1.4.1 BmNPV与Nb交叉感染 （1）以半数感染浓度（IC50）的Nb悬浮液0.4 mL涂抹于3张面积为12 cm2的桑叶上，饲喂1小区（30头）2龄起蚕（12 h），再以半数致死浓度（LC50）二分之一的BmNPV悬浮液0.4 mL涂抹3张面积为12 cm2的桑叶饲喂家蚕（12 h），重复2区，然后再常规饲养至5龄起蚕，放置1 d后对试验区的每一头蚕逐一研磨镜检，调查家蚕微粒子病发病率；同时以无菌水涂抹桑叶饲喂的蚕区作为阴性对照，以2龄起蚕单独感染Nb的蚕区做毒对照，即Nb对照（1）。

（2）取Nb与BmNPV混合感染，使混合液中的两种病原浓度分别为NbIC50和BmNPVLC50二分之一，以病原混合悬浮液0.4 mL涂抹于3张面积为12 cm2的桑叶上，饲喂1小区（30头）2龄起蚕（12 h），再常规饲养至5龄起蚕，调查家蚕微粒子病发病率；同时以无菌水涂抹桑叶饲喂的蚕区作为阴性对照，以2龄起蚕单独感染Nb的蚕区做毒对照，即Nb对照（1）。

（3）以半数致死浓度（LC50）二分之一的BmNPV悬浮液0.4 mL涂抹于3张面积分别为12 cm2的桑叶上，饲喂1小区（30头）2龄起蚕（12 h），再以半数感染浓度（IC50）的Nb悬浮液0.4 mL涂抹3张面积分别为12 cm2的桑叶饲喂家蚕（12 h），重复2区，然后常规饲养至5龄起蚕，放置1 d后对试验区的每一头蚕逐一研磨镜检，调查家蚕微粒子病发病率，同时以无菌水涂抹桑叶饲喂的蚕区作为阴性对照，以2龄蚕第二餐单独感染Nb的蚕区做毒对照，即Nb对照（2）。

1.4.2 BmCPV与Nb交叉感染 攻毒方式和调查方式同1.4.1。

1.4.3 Bt 与Nb交叉感染 攻毒方式和调查方式同1.4.1。

1.4.4 肠道菌与Nb交叉感染 攻毒方式和调查方式同1.4.1，以5.6×109mL-1浓度的肠道菌悬浮液进行攻毒。

1.4.5 白僵菌与Nb交叉感染 攻毒方式和调查方式同1.4.1。

2 试验结果

2.1 Nb对家蚕半数感染浓度（IC50）

采用家蚕微孢子虫（Nb）孢子悬浮液不同浓度（108～103个/ mL的10倍系列稀释液）感染家蚕，测定出Nb对家蚕半数感染浓度（IC50）为5.65×104mL-1（见表1），显现出Nb对家蚕具有较强感染力。

2.2 BmNPV 对家蚕半数致死浓度（LC50）

采用家蚕核型多角体病毒（BmNPV）悬浮液不同浓度（108～103个/ mL的10倍系列稀释液）感染家蚕，测定出BmNPV对家蚕半数致死浓度（LC50）为1.61×106mL-1（见表1）。家蚕感染BmNPV后，高浓度感染处理区内大部分蚕体已经未能正常入眠，在96 h后出现蚕儿体皮破裂，流出乳白色脓液，之后死亡。因此，BmNPV对家蚕显现出急性症状，具有较强感染力。

2.3 BmCPV 对家蚕半数致死浓度（LC50）

采用家蚕质型多角体病毒（BmCPV）悬浮液不同浓度（108～103个/ mL的10倍系列稀释液）感染家蚕，测定出BmCPV对家蚕半数致死浓度（LC50）为5.12×105mL-1（见表1）。BmCPV感染家蚕（2龄）后，到3龄后期就开始出现食欲减退、发育不齐等症状，到4龄期群体发育大小悬殊，蚕体瘦小，常呆伏于蚕座四周或残桑中，个别蚕排出的粪便有乳白色的黏液；到4龄后期陆续有死蚕，基本不能进入4龄眠。因此，BmCPV对家蚕属于慢性蚕病，根据LC50也说明其具有较强感染力。

2.4 Bt对家蚕半数致死浓度（LC50）

采用苏芸金杆菌（Bt）悬浮液不同浓度（108～103个/ mL的10倍系列稀释液）感染家蚕，测定出Bt对家蚕半数致死浓度（LC50）为4.56×104mL-1（见表1）。利用Bt悬浮液感染家蚕后，高浓度区立即出现蚕儿突然停止食桑，蚕体痉挛并吐液，之后死亡；在低浓度区逐步出现部分蚕儿食欲减退，排不正形粪，行动呆滞，少部分有吐液情况，倒卧而死；在低浓度区也出现部分蚕儿食欲减退后又能恢复食桑，发育逐步正常的蚕儿。因此，Bt感染是一种急性蚕病，根据LC50也说明其具有较强感染力。

2.5 家蚕肠道菌对家蚕的感染情况

采用家蚕肠球菌悬浮液不同浓度感染家蚕，在高浓度感染区（108mL-1、109mL-1）发现当龄蚕儿即表现出食欲减退、生长缓慢、发育不齐等现象；到下一龄（3龄）还出现个别偏小蚕死亡，但其它蚕儿出现食欲增加，生长加速的现象；在低浓度感染区（105mL-1、106mL-1）蚕儿未出现发病症状。因此，家蚕肠道菌对家蚕属于慢性致病性，而且感染力较低，以至于无法测定出其半数感染浓度。

2.6 白僵菌对家蚕半数致死浓度（LC50）

采用家蚕白僵菌分生孢子悬浮液不同浓度（108～103个/ mL的10倍系列稀释液）感染家蚕，测定出白僵菌对家蚕半数致死浓度（LC50）为1.32×106mL-1（见表1）。家蚕感染白僵菌病原后，高浓度感染处理区内第3 d即出现病死蚕，发病初期蚕儿反应迟钝，之后蚕体伸直死亡，逐渐发硬，经1～2 d尸体上长出白色菌丝。因此，白僵菌对家蚕具有急性致病性，根据LC50也说明其具有较强感染力。

表1 各种病原对家蚕的食下传染力调查

2.7 Nb与BmNPV联合感染结果

采取使家蚕先感染BmNPV再感染Nb或同时感染NPV与Nb或先感染Nb再感染BmNPV的3种方式调查BmNPV对家蚕微粒子病发生的抑制效果。如表2，发现先感染BmNPV再感染Nb和先感染Nb再感染BmNPV的试验方式有降低家蚕微粒子病发生率的情况，两者抑制率分别为9.54%和22.72%，而BmNPV与Nb同时感染方式没有抑制效果。因此，先感染Nb再感染BmNPV的试验方式抑制效果显著。在Nb与BmNPV交叉感染后，有部分蚕儿发生血液型脓病死亡。

2.8 Nb与BmCPV联合感染结果

采用同2.7三种方式调查BmCPV对家蚕微粒子病发生的抑制效果。如表2，发现先感染BmCPV再感染Nb或同时感染BmCPV与Nb方式对家蚕微粒子病发生没有抑制效果，而先感染Nb再感染BmCPV的方式抑制率达到18.18%，抑制效果显著。在两者交叉感染后期，有部分蚕儿发生中肠型脓病死亡。

表2 Nb与BmNPV和BmCPV的交叉感染的效果

2.9 Nb与Bt联合感染结果

采用同2.7三种方式调查Bt对家蚕微粒子病发生的抑制效果。如表3，发现先感染Bt再感染Nb和先感染Nb再感染Bt的交叉感染方式对家蚕微粒子病发生的抑制率分别为2.27%和6.67%；而同时感染NPV与Nb的方面没有抑制效果。因此，Bt对家蚕微粒子病发生的抑制效果不显著。在两种病原交叉感染后，有部分蚕儿有中毒症状死亡。

2.10 Nb与肠道菌联合感染结果

采用同2.7三种方式调查家蚕肠道菌对家蚕微粒子病发生的抑制效果。如表3，发现三种感染方式使肠道菌对家蚕微粒子病发生的抑制率分别为4.54%、2.22%和8.89%，抑制效果均不显著。因此，家蚕肠道菌对家蚕微粒子病发生的抑制效果较差。

表3 Nb与Bt和肠道菌的交叉感染的效果

2.11 Nb与白僵菌联合感染结果

采用同2.7三种方式调查家蚕白僵菌对家蚕微粒子病发生的抑制效果。如表4，发现三种感染方式使白僵菌对家蚕微粒子病发生的抑制率分别为0、2.22%和8.89%，抑制效果均不显著。因此，家蚕白僵菌对家蚕微粒子病发生的抑制效果较差。在两者交叉感染后，有部分蚕儿发生白僵病死亡。

表4 Nb与白僵菌交叉感染的效果

3 讨论

众多研究表明两种病原微生物联合感染寄主会互相影响感染力[1]。在蚕业生产中也广泛存在病原微生物对家蚕的混合感染的现象[3]，而且在蚕种生产中还经常发现发生其它病害后蚕种检疫毒率有偏低的现象。本文调查了家蚕微孢子虫（Nb）分别与BmNPV、BmCPV、家蚕肠道菌、苏芸金杆菌（Bt）和家蚕白僵菌交叉感染家蚕后微粒子病发生抑制情况，发现5种病原与Nb交叉感染后都存在降低家蚕微粒子病发生的效果，而且以Nb感染家蚕后再感染BmNPV 或BmCPV的方式抑制效果较明显，其他病原（家蚕肠道菌、Bt和家蚕白僵菌）交叉感染也有降低微粒子病发生情况，但效果不明显。

两种病原微生物联合感染寄主互相影响感染的机理可能有两种情况：（1）某种病原可以分泌一些成分（如抗菌蛋白）杀灭或干扰另一种病原，使别的病原活力降低[6]；（2）某种病原感染寄主后使寄主组织结构发生变化，有利于另一种病原的浸染[7]。因此，两种病原微生物联合感染寄主会存在一些感染率变化的情况。另外，在某种病原单独感染时，病原只需对抗宿主细胞的防御体系，而在交叉感染时，还要对抗其它病原的作用[3]，可能也是病原感染力变化的原因。

在本试验中，BmNPV、BmCPV、家蚕肠道菌、苏芸金杆菌（Bt）和家蚕白僵菌与Nb交叉感染都或多或少有降低家蚕微粒子病发生的效果，是何种拮抗机理有待深入研究。另外，在其他各种病原与Nb交叉感染后都存在发生其它病原引起病害致死的情况，是否是两种病原联合感染后加速蚕儿死亡，从而降低微粒子病发生率。因此，病原微生物间联合感染情况非常复杂，有待深入系统研究才能阐明原因，对此还需要进一步的研究。

［1］ 朱丽云，戴贤君，张富明，等.枯草芽孢杆菌对畜禽常见致病微生物体外拮抗作用的研究［J］.动物生产，2009，45（21）：41-43

［2］ 鲁兴萌，汪方炜.家蚕肠球菌对微孢子虫体外发芽的抑制作用［J］.蚕业科学，2002，28（2）：126-128.

［3］ 肖仕全，潘敏慧，万永继，等.家蚕病原微生物的交叉感染研究［J］.蚕学通讯，2003，23（3）：1-5.

［4］ 刘广生，牟志美，陈春花.苏芸金杆菌与核型多角体病毒对家蚕的联合致病作用［J］.蚕业科学，2005，31（2）：195-198.

［5］ 浙江大学.家蚕病理学［M］.北京：中国农业出版社，2000：242.

［6］ 黄旭华，廖富蘋，林健荣，等.CP7菌株抗菌物质对真菌的活性及其作用机制研究［J］.生物技术通报，2012（9）：125-130.

［7］ 于淑池，徐亚茹.拮抗细菌产生的活性物质及拮抗机理研究进展［J］.承德职业学院学报，2006（1）：67-69.

S884.21；

A；

1006-1657（2016）02-0016-4

2016-02-20；

2016-04-25

广西壮族自治区蚕业科学研究院青年基金项目（No.201213）。

信息］黄旭华（1979—），男，研究生，高级农艺师，主要从事蚕病防治研究工作。E-mail：hgisoi@163.com