不同消毒方法对家蚕微粒子的存活和侵染力影响

李玲利,苏振国,张永红,邵榆岚,白兴荣

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661101)

家蚕微粒子Nosemabombycis是家蚕驯养中发现的一种专化寄生于家蚕细胞内的病原,长期与家蚕协同进化后其增殖、能量代谢高度依赖宿主家蚕,微粒子侵入家蚕体内后可呈J型指数增殖方式快速引起家蚕微粒子病爆发,扩繁的病原通过蚕业生产的产品和废弃物等携带分布于养蚕区域环境中,在适宜条件下通过水平和垂直传播再侵染家蚕完成其生活史和病原再扩展分布(刘吉平等,2000;孙胜,2001;胡必利等,2010;鲁兴萌等,2016;高兴珂等,2021)。

目前生产中根据微粒子水平和垂直传播特点,制定的防治方法是通过家蚕母蛾微粒子病检验技术控制阻断垂直传播,养蚕环节以防止微粒子水平感染家蚕为主,具体的措施有对桑叶叶面消毒和防治桑园害虫以防止家蚕食下野外昆虫传播的病原微粒子,饲喂喷洒苯并咪唑类杀菌剂多菌灵的桑叶预防和治疗家蚕微粒子病,洗消家蚕饲喂环境降低家蚕微粒子密度减少家蚕染病机率(黄旭华等,2016;廖森泰等,2016),常用的消毒方法是使用含氯消毒剂从养蚕前、中、后全程进行大面积洗消,含氯消毒剂由于见光不稳定,使用量大且使用周期长,加之对人和养蚕设施用具有强烈的刺激性和腐蚀性,一部分消毒液还会通过径流或河道进入土壤和水体对微生物、水生植物和动物群落结构产生影响,破坏土壤和水生态功能(叶利兰等,2021)。

为了寻找更多较传统消毒方法更高效、安全、环保的靶向性消毒技术,消灭净化残存于养蚕环境和蚕具中病原微粒子(鲁兴萌等,2013;鲁兴萌等,2016),本研究开展了温度、紫外线和消毒剂3种不同消毒方法对家蚕微粒子病原灭活后染色试验和3龄起蚕添食消毒处理微粒子后的致死和侵染试验,现将双重验证试验报告如下,以其为蚕业生产中的微粒子消杀提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试家蚕品种及家蚕微粒子

供试家蚕品种为菁松×皓月,来源于云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所,在25℃、L∶D=16∶8条件下用桑叶养至3龄起蚕备用。家蚕微粒子由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所家蚕病研究室保存,添食家蚕发病后,收集病蚕,研磨过滤后离心得到纯化微粒子,用血球计数板加无菌水调整微粒子悬液浓度为108个/mL备用。

1.2 不同温度对家蚕微粒子的活性和致病力影响

试验设5个温度处理40、45、50、55、60℃,取108个/mL家蚕微粒子悬浮液1 mL分装至1.5 mL离心管中在水浴锅中加热,每个温度设2个处理时间30 min和1 h,每个处理设6个重复,微粒子悬浮液常温处理为阳性对照,使用灭菌水为空白对照。取不同温度时间处理后的微粒子悬液涂片,待未干时滴加0.1%亚甲基蓝染色1～2 min后显微镜检并用血球计数板计数,死粒子被染上不同程度的蓝色,而活粒子不着色,观察时每个视野内数100个粒子,观察死亡粒子个数,计算死亡率(杜立新等,2018)。

取不同温度时间处理微粒子悬液、阳性对照微粒子悬液和阴性对照灭菌水均匀涂抹于桑叶,晾干后添食3龄饷食家蚕,添食1次病原处理后正常饲养,在室温25℃,L∶D=16∶8条件下饲养,每天给桑3次,每处理30头,每处理设3个重复。饲喂过程中收集死蚕镜检感染情况并记录,添食10 d以后收集剩余的家蚕调查感染微粒子虫情况(陈世良等,2018)。

1.3 紫外线对家蚕微粒子的活性和致病力影响

参照文献(杜立新等,2018)的方法并作改进,试验中将108个/mL微粒子悬浮液分装至12孔细胞培养皿中,每皿加入1 mL,使用20 wx功率的紫外灯照射紫外线,照射距离为50 cm和100 cm,每处理设4个照射时间为6、9、12、15 min,期间每照射1 min搅拌1次培养皿中的微粒子悬浮液,微粒子悬浮液不照射紫外线为阳性对照,灭菌水为空白对照,每个处理设6个重复,紫外线对微粒子的染色活性试验和添食家蚕侵染性试验方法参照温度处理微粒子试验。

1.4 消毒剂对家蚕微粒子的的活性和致病力影响

参照文献(黄旭华等,2010)采用微粒子和消毒剂混合法试验,取灭菌1.5 mL离心管,每处理取6个离心管,分别加入经摇匀的108个/mL微粒子悬浮液0.5 mL和消毒剂0.5 mL,使其达到说明书推荐使用的剂量(三氯异氰脲酸的浓度为800 mg/L、1 600 mg/L、3 200 mg/L,戊二醛癸甲溴铵浓度为67 mg/L、100 mg/L、200 mg/L),微粒子悬浮液加入灭菌水处理为阳性对照,单独的灭菌水为空白对照,分别在振荡器上轻轻振荡摇匀、离心、洗净,再离心,时间设为6 min、8 min、12 min(含离心时间),最后离心得到沉淀后加入灭菌水0.5 mL,振荡,使孢子充分悬浮备用,消毒剂对微粒子染色活性试验和添食侵染性影响试验方法参照温度处理微粒子试验。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel和DPS 7.05计算、分析。

2 结果与分析

2.1 不同温度条件处理后对家蚕微粒子存活和侵染性影响

温度对家蚕微粒子的活性和侵染力有显著影响,随着试验处理温度的升高,家蚕微粒子活性和侵染性降低,相同的温度下处理的时间越长家蚕微粒子活性和侵染率越低。家蚕微粒子在40～60℃处理后,微粒子死亡率在25.43%以上,结合微粒子添食家蚕后的死亡率和侵染率,家蚕微粒子采用55℃以上温度处理30 min及以上时间,家蚕微粒子死亡率达到73.01%以上,对家蚕侵染率为57.78%以下,添食家蚕后3 d、6 d、10 d的死亡率为55.56%以下,较55℃以下温度处理呈显著下降,当试验温度达到60℃以上,处理时间为30 min以上时,家蚕微粒子死亡率为100%,对家蚕侵染率为0(表1)。

表1 在不同温度条件处理后对家蚕微粒子存活和侵染力影响

2.2 紫外线照射处理后对家蚕微粒子存活和侵染力影响

紫外灯不同照射距离下,距离越近微粒子活性越低,对家蚕侵染率也越低,20 wx功率紫外灯距离50 cm照射后,微粒子死亡率为28.43%～67.13%,添食后对家蚕的侵染率在0～21.64%,0、3、6、10 d的家蚕最高死亡率为14.10%～34.44%,照射距离为100 cm时,微粒子死亡率为5.33%～37.85%,添食后对对家蚕的侵染率在35.68%～100%,0、3、6、10 d的家蚕最高死亡率为33.02%～63.02%。相同照射距离下照射的时间越长家蚕微粒子活性越低,对家蚕侵染率越低,50 cm照射距离下,照射时间为9 min及以下时微粒子死亡率为28.43%～37.14%,添食后对家蚕的侵染率在10.10%～21.64%;当照射时间为12 min及上时微粒子死亡率为47.70%～67.13%,添食后对家蚕的侵染率为0,较9 min及以下处理时间微粒子活性和侵染率显著降低;照射距离为100 cm时,照射时间为6 min时微粒子死亡率为5.33%,添食后对家蚕的侵染率为100%,当照射时间为9 min及上时微粒子死亡率为9.17%～37.85%,添食后对家蚕的侵染率为35.68%～75.82%,较处理6 min时微粒子活性和侵染率显著降低(表2)。

表2 紫外线照射后对家蚕微粒子存活和侵染力影响

2.3 不同消毒剂处理后对家蚕微粒子存活和侵染力影响

试验所用的2种消毒药剂处理家蚕微粒子后的出现的死亡率和对家蚕的侵染率见表3。三氯异氰脲酸800 mg/L及以上浓度,处理6 min及以上时微粒子死亡率为100%,处理后的微粒子添食家蚕侵染率为0。戊二醛癸甲溴铵67～100 mg/L不同时间处理对家蚕微粒子虫的死亡率介于11.78%～49.18%之间,处理后的微粒子添食家蚕侵染率为31.36%～100%,添食后的家蚕10 d死亡率在33.34%～89.97%,随着戊二醛癸甲溴铵浓度升高为200 mg/L处理时间为6 min及以上时家蚕微粒子虫的死亡率和侵染率显著降低,死亡率为100%,处理后的微粒子对家蚕侵染率为0。

表3 消毒剂对家蚕微粒子的存活和侵染力影响

3 结论与讨论

本试验结果表明,3种消毒方式在一定的条件下对微粒子消杀均表现出较好的效果,但不同消毒方法可应用范围不同。试验中测定家蚕微粒子的杀灭温度为60℃处理30 min以上,高温杀灭微孢子主要是阻碍微粒子裂殖体的发育和生长(王璐等,2018),其可作为小型养蚕用具的消毒,如:蚕箔、蚕蔟等;试验中使用的20 wx功率紫外灯距离50 cm照射家蚕微粒子,照射时间12 min以上,可以有效杀灭微粒子,由于紫外线对家蚕等生物的遗传物质或免疫系统有影响(黄旭华等,2011),故使用时只能作为间接消毒方法使用,如对贮桑室地面角落、上蔟室地面、蚕室墙壁、蚕室门窗、蚕室顶棚等养蚕辅助设施的表面消毒。消毒剂方面比较了新型的高含氯消毒剂三氯异氰脲酸和醛类铵盐类混合消毒剂戊二醛癸甲溴铵,三氯异氰脲酸其主要作用机理是溶解微粒子的细胞壁后消解其细胞器使其死亡(黄旭华等,2010),其在800 mg/L及以上浓度,接触微粒子时间6 min以上均可以取得很好的消杀效果,含氯类消毒剂是目前蚕业生产中应用时间最久、范围最广、使用量最大的消毒剂,其缺点也较为明显,如对家蚕和人有强烈刺激性,对金属设备有强腐蚀性等;戊二醛癸甲溴铵是由醛类消毒剂戊二醛和铵盐类消毒剂癸甲溴铵混合而成消毒剂,戊二醛癸甲溴铵优点是毒性低,见光稳定、不易分解,对金属腐蚀影响较小,其主要消杀原理是破坏病原物的蛋白质和酶活性达到快速高效的协同消毒作用(徐秀荣等,2015;王利平等,2021),试验中对微粒子的消杀浓度为200 mg/L接触时间达到6 min及以上,其可作为蚕业生产中易受含氯类消毒剂腐蚀的蚕业设施和工具消杀微粒子替代使用。本试验中3种消毒方法,均采用了微粒子染色法和添食家蚕法进行了双重验证,其结果基本都是趋于一致,受限于试验规模和不同地区的养蚕环境,具体的操作条件可以在本试验基础上进一步摸索完善。