复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中ICAM-1和IL-6表达的影响

叶翠萍，向丽，童东，王文倩,曾勇

·药理毒理·

复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中ICAM-1和IL-6表达的影响

叶翠萍，向丽，童东，王文倩,曾勇

目的：观察复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中ICAM-1和IL-6表达的影响。方法：连续6周给家兔耳缘静脉注射阳离子化牛血清白蛋白制得肾炎模型，将动物分为空白对照组、模型对照组、复方保肾颗粒1.2、0.6、0.3 g．kg-1剂量组、醋酸地塞米松组，灌胃给药10周后，用免疫组化发检测ICAM-1和IL-6在家兔肾脏中的表达情况。结果：复方保肾颗粒能明显降低C-BSA肾炎模型家兔肾脏中ICAM-1和IL-6的积分光密度值。结论：复方保肾颗粒治疗慢性肾炎的作用机制可能为通过降低ICAM-1、IL-6这两种细胞因子的活性来达到抑制肾脏组织病变，从而达到改善肾功能的目的。

复方保肾颗粒；慢性肾炎；C-BSA；ICAM-1；IL-6

复方保肾颗粒是由黄芪、络石藤、鱼腥草等中药组成的临床科研经验方，具有祛风清热利湿，活血通络之功效，前期研究已经证实其对家兔C-BSA阳离子化牛血清白蛋白型实验性肾炎模型具有良好的治疗作用[1]，不仅能能降低模型家兔的尿蛋白、血清肌酐、尿素氮含量，还能减轻肾脏的损伤程度。临床上慢性肾炎是由循环免疫复合物（CIC）沉积于肾小球，从而引起一系列炎症反应而致，这一发病机制已经得到公认，因此动物模型也以免疫模型最佳。本文选取了细胞间粘附因子-1（ICAM-1）和白介素-6（IL-6）两种肾病常见的免疫炎症因子，通过检测其在家兔肾脏组织中的分布来进一步探求复方保肾颗粒可能的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

家兔，雌雄各半，体重1.8-2.0 kg。由成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（川）2008-24。

1.2 实验药物

复方保肾颗粒，由黄芪、络石藤、鱼腥草、土牛膝、水红花子等中药组成，经现代工艺提取浓缩成干浸膏并粉碎，与部分药材粉末混合成浸膏粉，每1 g浸膏粉含5 g生药量，批号：20120511，由成都中医药大学炮制与制剂教研室提供，测得浸膏粉中黄芪甲苷含量为0.379 mg．g-1，临用前用0.3%CMCNa配成浓度分别为0.12、0.06、0.03 g．mL-1的混悬液；醋酸地塞米松片，由浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号：20130123，临用前用0.3%CMC-Na配成浓度为0.01 mg．mL-1的混悬液。

1.3 实验试剂

天然牛血清白蛋白（BSA）、大肠杆菌内毒素：Sigma公司。无水乙二胺（EDA）：四川西陇化工有限公司。碳化二亚胺（EDC）：上海共价化学科技有限公司。兔抗ICAM-1、兔抗IL-6：博奥森生物技术有限公司。生物素化山羊抗兔IgG、辣根过氧化酶标记链霉素卵蛋白、显色剂DAB：北京中山金桥生物有限公司。阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)：参考Border[2]方法加以改进，制得阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA），于4℃保存，临用前溶于PH=7.4的磷酸盐缓冲液。

1.4 主要仪器

冷冻干燥机（北京五洲东方科技发展有限公司）；电热恒温水浴锅（浙江余姚工业仪表二厂）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；切片机（徕卡-1015，德国）；TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机；BMJ-Ⅲ型包埋机；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威医疗仪器有限公司）；倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；Motic BA400显微摄像系统（麦克奥迪公司）；Image-Pro Plus图像分析系统（Media Cybernetics，Inc.公司）；显微镜Motic BA400等。

2 方法[3～5]

2.1 模型制备

适应性喂养1周后，选取两次测尿蛋白均为阴性的家兔用于实验。预免疫：每只家兔每天耳缘静脉注射1 µg大肠杆菌内毒毒和1 mg C-BSA，连续7天。正式免疫：将预免疫的家兔每只每天耳缘静脉注射C-BSA 10 mg，连续6周（第6周剂量加倍）。

2.2 分组及给药

将造模成功的家兔按尿蛋白浓度、性别和体重均衡分组，随机分为五组：模型对照组(0.3%CMCNa)，复方保肾颗粒3个剂量组（1.2、0.6、0.3 g．kg-1），醋酸地塞米松组(0.1 mg．kg-1)，另取未经免疫的家兔作为空白对照组(0.3%CMC-Na)。按前述剂量连续灌胃给药10周。

2.3 取材处理

于给药结束后处死家兔，取相同部位的部分肾组织，10%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成 2 µm 的石蜡切片，采用SP法作肾脏组织ICAM-1、IL-1免疫组化检测。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中ICAM-1含量的影响 与空白对照组比较，模型组家兔肾脏组织ICAM-1积分光密度（IOD）值极显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，醋酸地塞米松组家兔肾脏组织ICAM-1积分光密度（IOD）值极显著降低(P＜0.01)，复方保肾颗粒1.2 g．kg-1高剂量组家兔肾脏组织ICAM-1积分光密度（IOD）值显著降低(P＜0.05)。复方保肾颗粒0.6 g．kg-1、0.3 g．kg-1剂量组虽无显著性差异（P＞0.05），但有改善趋势。结果见表1、图1。

表1 复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中ICAM-1表达的影响 (±S)

表1 复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中ICAM-1表达的影响 (±S)

注：与模型对照组比较, *p＜0.05,**p＜0.01

组别剂量(g．kg-1)动物数(只)ICAM-1(IOD)空白对照组——80.1180±0.0318**模型对照组——70.2453±0.0175复方保肾颗粒1.260.1739±0.0325*复方保肾颗粒0.670.1914±0.0421复方保肾颗粒0.370.2169±0.0068醋酸地塞米松组0.1×10-360.1521±0.0312**

图1 各组家兔肾脏组织ICAM-1免疫组织化学图片（IHC×200）

3.2 复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中IL-6含量的影响 与空白对照组比较，模型组家兔肾脏组织IL-6积分光密度（IOD）显著升高(P＜0.05)。与模型组比较，醋酸地塞米松组家兔肾脏组织IL-6积分光密度（IOD）显著降低(P＜0.05)，复方保肾颗粒1.2 、0.6、0.3 g．kg-1剂量组虽无显著性差异（P＞0.05），但均有不同程度的改善趋势。结果见表2、图2。

表2 复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中IL-6表达的影响(±S)

表2 复方保肾颗粒对C-BSA型肾炎家兔肾组织中IL-6表达的影响(±S)

注：与模型对照组比较, *p＜0.05

组别剂量（g．kg-1)动物数(只)ICAM-1(IOD)空白对照组——80.1776±0.0019*模型对照组——70.2270±0.0059复方保肾颗粒1.260.1907±0.0144复方保肾颗粒0.670.1902±0.0102复方保肾颗粒0.370.1935±0.0119醋酸地塞米松组0.1×10-360.1782±0.0068*

图2 各组家兔肾脏组织IL-6免疫组织化学图片（IHC×200）

4 讨论

近年来,随着分子生物学技术在肾脏病研究领域的应用，一系列具有重要致炎作用的炎症介质被认识，现已证实细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α在肾炎发病机制中具有重要作用[6]。此外，还有ICAM-1、bFGF、TGF-β、CTGF等细胞因子也参与了肾脏的疾病[7]。在肾小管、肾间质进行性损伤的过程中，巨噬细胞可产生多种炎症介质,如ICAM-1，它可作用于肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞使之活化，既促使肾小管上皮细胞及肾间质肌成纤维细胞产生细胞外间质，造成间质纤维化，又促使上述细胞进一步产生炎症因子造成病变的恶性循环[8]。

复方保肾颗粒是由多种中药组成的临床经验复方，在临床上治疗慢性肾炎之风湿热扰肾，肾络瘀痹证。前期药效学研究已经证实其能够降低肾炎模型家兔的尿蛋白和血清肾功能特征性指标的含量，还能减轻肾脏的损伤程度。在本实验中，将研究角度渗入到更深层次的水平进行探索，采用免疫组织化学法测定与肾炎相关的两个细胞因子（ICAM-1、IL-6）在家兔肾脏中的表达分布情况（积分光密度）。本实验结果表明，模型家兔肾脏中ICAM-1、IL-6的积分光密度值显著性增加（P＜0.01或P＜0.01），随着复方保肾颗粒的干预治疗后，各剂量组对模型家兔肾脏中ICAM-1、IL-6的积分光密度值有不同程度的降低作用，因此提示我们复方保肾颗粒治疗慢性肾炎的作用机制可能为通过降低ICAM-1、IL-6这两种细胞因子的活性来达到抑制肾脏组织病变，从而达到改善肾功能的目的。

[1] 林波,刘宇,向丽等.复方保肾颗粒对家兔C-BSA异种血清免疫复合型肾炎模型的影响[J]. 中药药理与临床,2014,30(3)：121.

[2] Border W A, Harry J W, Kamil E S, et al. Induction of membranousnephropathy in rabbits by administration of an exogenous cationic antigen： demonstration of a pathogenic role for electrical charge[J]. Journal of Clinical Investigation,1982,69(2)：451.

[3] 魏伟,吴希美,李元建.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社,2010：1218.

[4] 韩琳,张边江,陈志强.肾舒康对家兔C-BSA肾炎模型治疗作用的研究[J].河北中医药学报,2006,21(3)：5.

[5] 赵玉庸,陈志强,白云静,等.慢肾消对家兔实验性膜性肾炎的影响[J].中国中医基础医学杂志,2001,7(7)：36.

[6] 伍小波,徐嘉红,罗先钦.昆明山海棠对慢性肾炎大鼠血清中IL-1,IL-6及TNF-α的影响[J].中国中药杂志,2010,35(24)：3354.

[7] 国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册[M].北京：人民卫生出版社,1986.

[8] 佟丹丹,金晓明,张磊,等.IgA肾病中ICAM-1和bFGF的表达与肾小管、肾间质损伤的关系[J].哈尔滨医科大学学报,2004,38(2)：118.

（责任编辑：陈思敏）

The effects of Fufangbaoshen granule on expression of ICAM-1 and IL-6 in kidney tissue from rabbit with C-BSA nephritis

/YE Cui-ping, XIANG Li, TONG Dong, WANG Wen-qian, ZENG Yong //(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To investigate the effect of Fufangbaoshen granule on expression of ICAM-1 and IL-6 in kidney tissue from rabbit with C-BSA nephritis.Method:Nephritis model was established by continuously injection of cationization bovine serum albumin through rabbits’ ear vein for 6 weeks. Then the rabbits were divided into 6 groups： normal control group, model group, fufangbaoshen granule 1.2, 0.6, 0.3 g．kg-1group, dexamethasone group. After 10 weeks gavage administration of drugs, the expression of ICAM-1 and IL-6 from rabbits’ kidney tissue were observed.Result:Fufangbaoshen granule significantly decreased integral optical density(IOD) of ICAM-1 and IL-6 in rabbits’ kidneys.Conclusion:Fufangbaoshen granule treatment of chronic nephritis may be related to the decrease of the activities of ICAM-1 and IL-6 to inhibit renal tissue lesions and improve renal function.

Fufangbaoshen granule；chronic nephritis；C-BSA；CAM-1；IL-6

R 285.5

A

1674-926X(2016)05-011-004

四川省科技厅省青年科技创新研究团队专项计划项目（2014TD0007）

成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

叶翠萍，在读硕士研究生，主要从事中药药效与毒理研究

Tel：13688428398 Email：wsmm0827@126.com

曾勇，教授，主要从事中药药效与毒理研究

Tel：13882179818 Email：zengy1976@163.com

2015-12-20