美洲大蠊提取物抗肝损伤的实验研究

张彤，杨胜群，邹俊波，阙昌田，桑文涛，曾南

·药理毒理·

美洲大蠊提取物抗肝损伤的实验研究

张彤，杨胜群，邹俊波，阙昌田，桑文涛，曾南

目的：观察美洲大蠊活虫冷浸药渣水提物对小鼠急性肝损伤模型及CCl4所致大鼠慢性肝损伤模型的影响，为美洲大蠊抗肝损伤的临床应用及物质基础研究提供一定实验依据。方法：美洲大蠊活虫冷浸药渣水提物连续灌胃给予小鼠10天，分别采用灌胃醋氨酚、60%乙醇及腹腔注射CCl4进行小鼠急性肝损伤造模，测定模型小鼠血清ALT与AST水平、肝组织SOD与MDA水平及肝脏、脾脏指数以评价受试药物的抗急性肝损伤作用；采用每周两次灌胃CCl4，连续8周的方式制备慢性肝损伤大鼠模型，测定模型动物血清ALT、AST水平及肝、脾、胸腺指数以评价药物的抗慢性肝损伤作用。结果：美洲大蠊活虫冷浸药渣水提物49.13 mg．kg-1显著降低酒精性与CCl4性急性肝损伤模型小鼠血清AST、ALT水平(P＜0.05)，对醋氨酚模型小鼠血清AST、ALT水平有降低趋势(P＞0.05)，能显著性降低醋氨酚模型小鼠脾脏指数(P＜0.05)；65.51 mg．kg-1显著降低酒精性急性肝损伤模型小鼠血清ALT、AST水平(P＜0.05)，32.75 mg．kg-1显著降低血清ALT与肝组织MDA水平(P＜0.05)。美洲大蠊活虫冷浸药渣水提物75.78 mg．kg-1显著降低CCl4所致慢性肝损伤模型大鼠血清AST、ALT水平(P＜0.05)，45.76、 75.78 mg．kg-1显著提高模型大鼠胸腺指数(P＜0.05)，45.76 mg．kg-1明显降低肝脏指数(P＜0.05)。结论：美洲大蠊活虫冷浸药渣水提物具有抗急性和慢性肝损伤的作用，该部位可能是其保肝作用的物质基础之一。

美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物；醋氨酚性急性肝损伤；酒精性急性肝损伤；CCl4急性肝损伤； CCl4慢性肝损伤

美洲大蠊( Periplaneta americana L)属于昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂。全世界被发现并记录的蟑螂种类有3000余种，中国蟑螂种类记载已超过500余种，但其中被开发利用的仅有几种，美洲大蠊就是颇具代表性的一种[1]。美洲大蠊其药用历史最早见于《神农本草经》，之后的很多医药学专著都有记载，《本草纲目》曰：“蜚蠊，行夜， 螽三种，西南夷皆食之，混呼为负盘俗又讹盘为婆，而讳称为香娘子也”。中医认为美洲大蠊具有活血散瘀、解毒消疳、利尿消肿等功效，用于症瘕积聚，小儿疳积，脚气水肿，疔疮、肿毒及虫蛇咬伤。现代药理研究表明，美洲大蠊提取物具有抗肿瘤[2]、促进组织修复[3]、抗菌和抗病毒[4]、抗氧化[5]和保肝作用[6]。本研究基于前期工艺筛选结果，即美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物可能为其抗肝损伤的有效部位，为进一步明确其抗肝损伤作用，采用醋氨酚、60%乙醇及CCl4制备3种小鼠急性肝损伤模型，以及CCl4所致的大鼠慢性肝损伤模型，观察该提取物的保肝效应，旨在为其临床应用、工艺优化及物质基础寻找提供一定药理学依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级昆明小鼠，雄性，体重18～22 g；SD大鼠，雄性，体重160～180g ，均购自成都达硕实验动物有限公司，动物合格证：SCXK(川）2013-15。饲养于国家中医药管理局成都中医药大学中药药理科研三级实验室（NO.TCM-2009-315），室内光照、湿度、温度适宜，通风条件良好，环境相对安静，每笼6～7只。

1.2 药物

美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物，由成都百草和济科技有限公司提供，出膏率5.3%。提取工艺：取美洲大蠊活虫适量，低温下75%乙醇粉碎，过滤，药渣加10倍量水溶液提取2次，第一次提取1.5 h，第二次1 h，合并水提溶液，减压浓缩并干燥，得活虫冷浸药渣水提取物。联苯双酯滴丸，批号A02131003，浙江万邦药业股份有限公司。对乙酰氨基酚，批号140301，成都市天台山制药有限公司。

1.3 试剂

无水乙醇(批号2015010401，成都市科龙化工试剂厂) ；四氯化碳（批号2014011601，成都市科龙化工试剂厂）。AST试剂盒（批号20150107、20150512、20150611、20151107）、ALT试剂盒（批号20150107、20150512、20150611、20151107）、SOD试剂盒（批号20150618、20150917）、MDA试剂盒（批号20150508、20150617）、胆红素试剂盒（批号20150109），均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要仪器

电子天平（型号BS323S，精度0.001，北京赛多利斯仪器系统有限公司）。数控超声波清洗器（型号DL720D，上海之信仪器有限公司）。ARIOSKAN FLASH 2.4.3全波长多功能读数仪(型号3001，美国Thermo公司)。台式高速冷冻离心机（型号ST16R，美国Thermo公司）。台式低速离心机（型号TD24AWS,湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对醋氨酚致小鼠急性肝损伤的影响

健康SPF级昆明种小鼠，适应性喂养3 d后，随机分为空白对照组、模型对照组、联苯双酯组（5.8 mg．kg-1）、美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物低(32.75 mg．kg-1)、中(49.13 mg．kg-1)、高剂量(65.51 mg．kg-1)组。各组小鼠按0.2 ml/10g 给药体积灌胃相应的药物，空白组和模型组小鼠灌胃给予等量蒸馏水，连续灌胃10 d。末次给药2 h后，除空白组外其余各组小鼠灌胃200 mg．kg-1醋氨酚进行造模，空白组灌胃给予等量溶剂。造模后小鼠禁食不禁水16 h，小鼠取血分离血清，检测AST、ALT活力，并剖取脾脏和肝脏称重，计算脏器指数[7]。所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果见表1。

表1 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对醋氨酚致小鼠急性肝损伤模型的影响(±S)

表1 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对醋氨酚致小鼠急性肝损伤模型的影响(±S)

空白对照—5.35±0.79 0.42±0.11 28.03±7.12**12.05±4.71**模型对照—5.06±0.36 0.44±0.1339.07±7.9931.56±7.45联苯双酯5.84.79±0.35 0.34±0.05*37.11±5.6038.32±8.32

注：与模型组比较，*P＜0．05， **P＜0．01；n=8-12

结果表明，与空白组比较，模型组小鼠血清AST、ALT活性明显增高（P＜0.01），提示模型成功；与模型对照组比较，美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物 49.13mg/kg剂量对血清AST、ALT活性异常增高有降低趋势，此外其能显著降低模型小鼠的脾脏指数（P＜0.01）。

2.2 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对酒精所致小鼠急性肝损伤模型的影响

动物分组、给药方法及给药周期同实验2.1。各组连续灌胃10 d，末次给药后2 h，除空白组外其余各组小鼠灌胃60%乙醇14 mL．kg-1造模，空白组灌胃等量溶剂。造模后小鼠禁食不禁水8 h，小鼠取血分离血清，检测AST、ALT活力，同时剖取小鼠脾脏和肝脏称重，计算肝脏、脾脏指数[8]，并用生理盐水制备10%肝脏匀浆，检测SOD、MDA水平。所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果见表2、表3。

表2 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对酒精性急性肝损伤模型小鼠脏器指数及酶活性的影响（±S）

表2 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对酒精性急性肝损伤模型小鼠脏器指数及酶活性的影响（±S）

注：与模型组比较，*P＜0.05, **P＜0.01；n=8-12

组别剂量肝脏指数 脾脏指数ASTALT ( mg．kg-1)(g/100g)(g/100g)（U/L）（U/L）空白对照—5.35±0.79 0.42±0.11 28.03±7.12**12.05±4.71**模型对照—5.03±0.42 0.30±0.05 52.32±22.61 70.56±23.41联苯双酯5.84.66±0.80 0.32±0.05 47.23±15.32 59.16±12.58水提物32.755.06±0.35 0.29±0.05 50.30±11.4651.42±8.34*水提物49.135.12±0.44 0.38±0.09 33.74±5.90*55.85±9.61*水提物65.514.89±0.34 0.29±0.06 32.52±7.58**36.55±14.81**

表3 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对酒精性急性肝损伤模型小鼠肝组织SOD、MDA水平的影响（±S）

表3 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对酒精性急性肝损伤模型小鼠肝组织SOD、MDA水平的影响（±S）

注：与模型组比较，*P＜0.05

MDA (nmol/mgprot)空白对照—12754.41±193.047.25±1.66模型对照—10626.55±164.946.64±3.28联苯双酯5.810746.27±69.514.65±1.23水提物32.7511746.63±73.894.2±1.49*水提物49.1311709.94±62.664.94±2.05水提物65.518694.61±57.25.34±1.37组别剂量(mg．kg-1)样本（n）SOD（U/mgprot）

结果表明，与空白对照组比较，酒精性急性肝损伤模型小鼠血清AST、ALT活性明显增高（P＜0.01），提示模型成功；与模型对照组比较，美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物49.13、65.51 mg．kg-1剂量显著性降低血清AST、ALT活力（P ＜0.01或P ＜0.05），32.75 mg．kg-1显著性降低血清ALT活性及肝组织MDA水平（P ＜0.05）。

2.3 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对四氯化碳急性肝损伤小鼠模型的影响

健康SPF级昆明种小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、联苯双酯组（5.8 mg．kg-1）、美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物组(49.13 mg．kg-1)，连续灌胃给药10 d。末次灌胃给药2 h后，。0.35% CCl4植物油溶液0.01mL/10 g腹腔注射造模，造模后禁食不禁水22 h，小鼠取血分离血清，检测AST、ALT和总胆红素水平，剖取小鼠脾脏和肝脏称重，计算肝脏、脾脏指数[6]，并用生理盐水制备10%肝脏匀浆，检测SOD、MDA水平。所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果见表4、表5。

表4 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对CCl4急性肝损伤模型小鼠脏器指数及肝功能的影响（±S）

表4 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对CCl4急性肝损伤模型小鼠脏器指数及肝功能的影响（±S）

注：与模型组比较，*P＜0.05, **P＜0.01；n=8-12

总胆红素(μmol.L-1)空白对照-5.20±0.720.37±0.094.41±3.68*6.85±13.97**0.14±0.05*模型对照-5.27±0.570.37±0.1124.8±18.54 121.40±57.74 0.32±0.19联苯双酯5.84.79±0.260.36±0.096.3±2.95**68.3±47.80**0.32±0.11水提物49.134.96±0.390.34±0.168.39±4.77*38.3±37.05**0.29±0.11组别剂量(mg．kg-1)肝脏指数（g/100g）脾脏指数（g/100g）AST（U/L）ALT（U/L）

表5 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对CCl4急性肝损伤模型小鼠肝组织SOD、MDA水平的影响（±S）

表5 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对CCl4急性肝损伤模型小鼠肝组织SOD、MDA水平的影响（±S）

注：与模型组比较，**P＜0.01。

MDA ( nmol/mgprot )空白对照-10568.3±62.64**3.43±0.60模型对照-11477.01±36.133.42±1.03联苯双酯5.811521.73±213.003.13±0.88水提物49.1311493.63±73.452.41±0.48**组别剂量(mg．kg-1)样本（n）SOD（U/mgprot）

结果表明，与空白对照组比较，CCl4急性肝损伤模型小鼠血清AST、ALT活性明显增高（P＜0.01），提示造模成功；与模型组比较，美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物49.13mg．kg-1显著性降低血清AST、ALT活性及肝组织MDA水平（P ＜0.05或P＜0.01）。

2.4 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对四氯化碳慢性肝损伤大鼠模型的影响

取健康SD大鼠，按体重分层随机正常对照组、模型对照组、联苯双酯组（1.93 mg．kg-1）、美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物低、高剂量组（45.56、75.78 mg．kg-1）。除正常对照组外，其余各组大鼠按 1 mL．kg-1灌胃 40% CCl4橄榄油溶液造模，每周 2次，连续8周，正常对照组给予等体积橄榄油。造模第二周开始灌胃给药，正常对照及模型组给予等体积水溶液，连续给药 7周，每周称重一次。末次给药后，大鼠禁食不禁水16 h，称体重，腹主动脉取血分离血清；剖取大鼠肝脏、脾脏、胸腺，称重计算肝、脾、胸腺指数。按试剂盒说明检测血清AST、ALT水平[9]。所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析。结果见表6。

表6 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提物对CCl4致慢性肝损伤大鼠模型的影响（±S）

表6 美洲大蠊活虫冷浸药渣水提物对CCl4致慢性肝损伤大鼠模型的影响（±S）

注：与模型组比较 ，*P＜0.05, **P＜0.01

ALT（U/L ）空白对照-102.59±0.19*0.19±0.040.10±0.03**26.61±6.26**20.42±8.95**模型对照-132.98±0.470.22±0.050.06±0.02281.87±69.11374.65±87.84联苯双酯1.9382.64±0.220.19±0.030.10±0.02**147.41±37.03**102.04±19.54**水提物45.5682.59±0.16*0.20±0.030.10±0.03**291.46±40.07343.80±31.34水提物75.7893.05±0.320.21±0.070.11±0.04**190.88±84.44*268.66±69.62**组 别剂量(mg．kg-1)样本（n）肝脏指数（g/100g）脾脏指数（g/100g）胸腺指数（g/100g）AST（U/L ）

结果表明，与空白对照组比较，模型组大鼠血清AST和ALT活性、肝脏指数显著性升高（P ＜0.05或P＜0.01），提示模型动物存在肝功能异常表现；与模型组比较，美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物75.78 mg．kg-1显著降低血清AST、ALT活性，45.76、 75.78 mg．kg-1能明显提高模型大鼠胸腺指数，45.76 mg．kg-1显著降低模型大鼠肝脏指数。

3 讨论

在评价药物抗肝损伤作用的实验研究中，醋氨酚所致急性肝损伤模型是药物性肝损伤的代表模型，此外酒精性肝损伤与CCl4所致的化学性肝损伤模型也常被采用。醋氨酚可使小鼠肝脏过氧化反应增强, 产生过多自由基而引起肝细胞膜脂质过氧化造成细胞损伤[10]，大剂量的醋氨酚在代谢过程中产生大量N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)，后者有亲电性和强大氧化作用，与生物大分子共价结合，导致蛋白质巯基被氧化和芳香基化，以及生物膜系统发生脂质过氧化，引起肝细胞变性坏死[11]。酒精性肝损伤是临床常见的肝脏疾病，包括急性酒精性肝损伤、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。当机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶(ADH)的催化下，乙醇氧化成乙醛，而乙醛作为黄嘌呤氧化酶的底物会激活黄嘌呤氧化酶，使超氧阴离子和自由基生成增加，引起脂质过氧化，造成肝细胞膜损害，引起肝脏功能紊乱[12-14]。CCl4是致急、慢性肝损伤动物模型的常用化学试剂，CCl4进入体内后，经肝脏细胞色素 P450 的代谢，生成三氯甲基自由基，后者则激发细胞膜发生脂质过氧化反应，引起膜结构和功能完整性的破坏，导致肝脏功能受损[15]。上述所有肝损伤动物模型，无论急性还是慢性均会表现出血清ALT、AST活性异常升高，即提示肝功能异常，受试药物如能对抗两种酶活性的异常升高，则表明药物具有一定的抗肝损伤作用。

本次实验发现，美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物对酒精性急性肝损伤模型，CCl4致急、慢性肝损伤模型动物血清转氨酶活性的异常增高，均有显著降低作用，对醋氨酚所致急性肝损伤模型小鼠血清转氨酶活性有降低趋势；同时实验表明，药物能降低CCl4急性肝损伤模型小鼠肝组织MDA含量；能提高CCl4所致慢性肝损伤模型大鼠的胸腺指数，降低肝脏指数。由此提示，美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物具有抗肝损伤作用，作用发挥可能与其提高机体免疫功能、抗氧化及促进修复等环节相关。美洲大蠊活虫冷浸药渣水提取物可能是其保肝效应发挥的主要物质基础。究其保肝效应的进一步分子作用机制及有效成分的进一步分离、验证，有待深入研究。

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（责任编辑：陈思敏）

Study on the effects of Periplaneta americana L extract on liver injury

/ZHANG Tong, YANG Sheng-qun, ZOU Jun-bo, QUE Chang-tian, SANG Wen-tao, ZENG Nan//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:This study was aimed to investigate the effect of water extract of Periplaneta americana L by cooling extraction on live insects (WEoPa) on acute liver injury in mice and CCl4-induced chronic liver injury in rats, so as to provide certain experimental basis for the clinical application and basic research of Periplaneta americana L on anti-liver injury.Method:WEoPa was intragastricly administered to mice for 10 days. Then acute liver injury animal models were established by gavage of paracetamol, 60% alcohol and intraperitoneal injection of CCl4, respectively. The activities of alanine aminotransferase (ALT) and glutamic oxalacetic transaminase (AST) in serum, superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in liver were determined. Viscera indices such as liver and spleen were calculated to evaluate the effect of WEoPa on acute liver injury in mice. The chronic liver injury animal model was established by intragastric administration of CCl4to rats twice a week for 8 weeks, then WEoPa was intragastricly given for 7 weeks. The levels of ALT and AST in serum, viscera indices such as liver, spleen and thymus were calculated to evaluate the effect of WEoPa on chronic liver injury in rats.Result:Intragastric administration of 49.13 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease the levels of ALT and AST in serum of acute liver injury mice induced by alcohol and CCl4(P＜0.05), and tended to decrease the levels of ALT and AST in serum (P＞0.05) while obviously decrease the spleen indices of mice induced by paracetamol (P＜0.05). 65.51 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease the levels of ALT and AST in serum (P＜0.05), while 32.75mg．kg-1can significantly decrease the levels of ALT in serum and MDA in liver tissue of acute liver injury mice induced by alcohol (P＜0.05). 75.78 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease the levels of ALT and AST in serum (P＜0.05), while 45.76 and 75.78 mg．kg-1WEoPa can significantly increase thymus indices, 45.76 mg．kg-1WEoPa can obviously decrease liver indices of chronic liver injuryrats induced by CCl4 (P＜0.05).Conclusion:WEoPa has protection effects on acute and chronic liver injury, suggesting that it’s maybe one of the important material basis playing the role of anti-liver injury.

Water extract of Periplaneta americana L; paracetamol-induced acute liver injury; alcohol-induced acute liver injury; CCl4-induced acute liver injury; CCl4-induced chronic liver injury

R 285.5

A

1674-926X(2016)05-009-04

四川省科技厅中药药理四川省青年科技创新研究团队（2014TD0007）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 610075

张彤，在读硕士研究生，主要从事中药药效学研究

Tel：18382148201 Email：983324561@qq.com

曾南，教授，主要从事中药药效与毒理研究

Tel：13198502352 Email：zengnan966@126.com

2016-02-18