p16、RASSF1A在肝细胞性肝癌患者肿瘤组织及血浆中异常甲基化的检测及临床意义

董晓刚，郭文佳，丁伟



p16、RASSF1A在肝细胞性肝癌患者肿瘤组织及血浆中异常甲基化的检测及临床意义

董晓刚，郭文佳，丁伟

【摘要】

目的探讨原发性肝细胞性肝癌（HCC）患者肿瘤组织及血浆中 p16 及 RASSF1A 启动子区的甲基化状态及其在HCC 早期无创诊断中的意义。

方法采用甲基化特异性 PCR 技术检测 60 例 HCC 患者肿瘤组织、癌旁组织、血浆及 60 例正常肝脏患者肝组织及血浆中 p16、RASSF1A 基因启动子区域的甲基化状态，分析其与肝癌患者临床病理参数之间的关系。

结果60 例 HCC 患者血浆、肿瘤组织及癌旁中 p16 基因甲基化率分别为 68.3%（41/60）、63.3%（38/60）和 41.7% （25/60）；RASSF1A 基因异常甲基化检出率分别为 73.3% （44/60）、70.0%（42/60）和 36.7%（22/60）；60 例正常肝脏患者肝组织及血浆 p16、RASSF1A 未检测到基因启动子区域的甲基化，差异有统计学意义（P = 0.000）。HCC 患者外周血浆和癌组织中 p16、RASSF1A 基因的甲基化率与患者年龄、性别、AFP、有无肝炎病毒感染（HBV）、有无肝硬化、Child 分级、肿瘤个数、包膜完整与否、有无癌栓、是否复发、病理分级、肿瘤分期无统计学相关性。

结论HCC 患者肿瘤组织及血浆 DNA 中可检测到RASSF1A 基因和 p16 基因的甲基化，外周血 p16 基因和RASSF1A 基因的甲基化检测对肝癌筛查有重要意义，可能成为 HCC 新的肿瘤分子标记物。

【关键词】癌，肝细胞；p16 基因；RASSF1A 基因；启动子区甲基化；血浆

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术， 2016， 11（3）：252-258

作者单位：830011 乌鲁木齐，新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科（董晓刚、丁伟），肿瘤研究所（郭文佳）

原发性肝细胞性肝癌（HCC）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，但其发生的分子机制目前尚不清楚。随着现代医学的发展，尽管手术、肝动脉灌注化疗栓塞、射频消融、微波消融、肝移植等多种治疗手段被广泛应用于临床，但总体治疗效果欠佳，故早期诊断并进行治疗对 HCC 预后具有重要意义［1］。

甲胎蛋白（AFP）是目前临床常用的 HCC 诊断的指标，AFP 可以在大约 80% 的成人肝癌患者血清中升高，但并不是 AFP 升高就一定意味着HCC 的发生，妊娠、生殖胚胎恶性肿瘤、急性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬化患者血清 AFP 都会有轻度或中度升高，也不是所有的 HCC 患者都有AFP 的升高。因此，寻找微创和简捷的检测方法是HCC 治疗新的研究方向。

肿瘤抑制基因（tumor suppression gene，TSG）启动子区域 CpG 岛的异常高甲基化可以改变染色质空间结构，进而导致肿瘤抑制基因的低表达或不表达，但该基因的 DNA 序列并没有发生改变，被认为在恶性肿瘤的发生及发展中起到了重要作用［2］，肝癌也不例外。

本研究应用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR，MSP）技术，检测 60 例HCC 患者肿瘤组织、癌旁组织、血浆中 p16、RASSF1A 基因启动子区域的甲基化状态，并检测60 例正常肝脏患者肝组织及血浆 p16、RASSF1A基因启动子区域的甲基化水平，结合肿瘤患者临床资料，以探讨 p16、RASSF1A 基因启动子区域异常甲基化在 HCC 患者血浆和组织中的一致性，及血浆 DNA 甲基化检测在 HCC 早期筛查中的临床应用价值。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1标本收集共收集 2011 年 1 月至 2013 年 12 月新疆医科大学附属肿瘤医院肝胆胰外科手术治疗的 60 例 HCC 患者血浆及组织标本，所有样本患者均经病理确诊，排除其他内分泌、免疫性、代谢性疾病，术前均未行介入、化疗、放疗等其他抗肿瘤治疗。其中男性 35 例，女性 25 例；血浆 AFP ≥ 400 μg/L 者 56 例，AFP ＜ 400 μg/L 者 4 例；HBV 感染 58 例；合并肝硬化者 48 例；肝功能 Child 分级：A 级 58 例，B 级 2 例；肿瘤个数：单发者 53 例，多发者 7 例；包膜完整者 44 例，无包膜或包膜不完整者 16 例；60 例正常肝组织及血液取自未合并慢性乙型病毒性肝炎的肝海绵状血管瘤手术患者。所有患者均签署知情同意书并详细告知样本收集目的及用途。HCC患者及正常对照者血液 EDTA 用抗凝管采血 4 ～8 ml 后以 3000 r/min 离心 10 min，分离血浆，血浆分装于 1.5 ml Eppendof 管，-80 ℃ 冰箱保存待用或立即提取 DNA。

1.1.2试剂QIAmpDNA Blood Mini Kit 试剂盒和 DNA 提取试剂盒购自德国 Qiagen 公司；MethylampTMOne-Step DNA Modification Kit 试剂盒购自美国 Epigentek 公司。

1.2方法

1.2.1DNA 提取①抗凝血离心分离后得到血浆标本，采用 QIAmpDNA Blood Mini Kit 试剂盒提取血浆 DNA，按说明书进行操作。②取癌组织及癌旁组织约 25 mg，按说明书采用 DNA 提取试剂盒提取癌组织 DNA。提取的 DNA 用紫外分光光度计检测浓度和纯度，提取的 DNA 置于 -20 ℃冰箱保存或立即行亚硫酸化修饰。

1.2.2DNA 亚硫酸化修饰按照 MethylampTMOne-Step DNA Modification Kit 试剂盒中的说明进行操作。发生甲基化的 DNA 在修饰后不发生序列改变，而未发生甲基化的 DNA 在修饰后 CpG 中5′ 端的“C”将变成“U”。然后运用甲基化特异性 PCR 扩增后分析甲基化状态。

1.2.3甲基化特异性 PCRp16 和 RASSF1A 基因引物序列及反应条件如表1。反应体系总体积为25 μl，组成为：MiliiQ H2O 13.4 μl；10 × PCR 缓冲液 II 2.5 μl；MgCl22.5 pl；2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl；Ampli Taq Gold 0.1 μl；甲基化或非甲基化引物 F 1.0 μl；甲基化或非甲基化引物 R 1.0 μl；已修饰的DNA 2 μl。PCR 条件：95 ℃ 预变性 10 min；继以95 ℃ 1 min，退火温度 1 min，72 ℃ 1 min 共 45 个循环。最后于 72 ℃ 延伸 10 min，4 ℃ 冷却。扩增产物经 2% 的琼脂凝胶电泳，紫外凝胶成像仪拍照。阴性对照不加模板 DNA 进行 PCR 扩增。

1.2.4结果判断琼脂凝胶电泳出现甲基化引物扩增条带判定该组织甲基化为阳性；当出现非甲基化引物扩增条带未出现甲基化扩增条带，判定该组织为甲基化阴性。甲基化和非甲基化引物均扩增出条带，判定其为部分甲基化，亦表示甲基化阳性。

1.3统计学处理

采用 SPSS17.0 软件对数据进行统计分析，计数资料采用 χ2检验，计量资料采用 t 检验，肝癌组织基因甲基化与临床资料的关系采用四格表确切概率法，P ＜ 0.05 表示差异具有统计学意义。

2　结果

表1　p16 和 RASSF1A 基因引物序列及甲基化特异性 PCR 反应条件Table 1　Primers sequences and conditions of the methylated PCR （MSP）

2.1p16 和 RASSFlA 基因的甲基化水平

p16 基因在 60 例 HCC 患者癌组织中的甲基化率为 63.3%（38/60），在癌旁组织中甲基化率为 41.7%（25/60），在 HCC 患者血浆中的甲基化率为 68.3%（41/60），见图1 和图2；MSP 法检测癌组织、癌旁组织及 HCC 患者血浆 p16 基因甲基化结果示意见图3。对照肝脏海绵状血管瘤患者肝组织及血浆 p16 基因未检测到启动子区域的甲基化，p16 甲基化率癌组织与癌旁组织比较有统计学意义（χ2= 5.65，P ＜ 0.05），癌组织与肿瘤患者血浆比较差异无统计学意义（χ2= 0.33，P ＞0.05），癌旁组织与 HCC 患者血浆比较差异有统计学意义（χ2= 0.62，P ＜ 0.05）；HCC 患者癌组织与血浆中的甲基化发生率呈正相关性，相关系数为r = 1（P = 0.003）。

图1　p16 基因在组织标本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 1　The methylated rate of p16 in tissues （*P ＜ 0.05）

图2　p16 基因在血浆标本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 2　The methylated rate of p16 in plasma （*P ＜ 0.05）

M：甲基化引物扩增条带；U：非甲基化引物扩增条带；T：癌组织；P：血浆M： Methylated； U： Unmethylated； T： Tumor tissues； P： Plasma图3　肝癌组织（T1 ～ T4）和肝癌患者血浆（P1 ～ P4）p16 甲基化情况Figure 3　The methylated status of p16 in tumor tissues （T1 - T4） and plasma （P1 - P4）

图4　RASSF1A 基因在组织标本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 4　The methylated rate of RASSF1A in tissues （*P ＜0.05）

图5　RASSF1A 基因在血浆标本中的甲基化率（*P ＜ 0.05）Figure 5　The methylated rate of RASSF1A in plasma （*P ＜0.05）

RASSF1A 基因在 60 例 HCC 患者癌组织中的甲基化率为 70.0%（42/60），在癌旁组织中甲基化率为 36.7%（22/60），见图4，在 HCC 患者血浆中的甲基化率为 73.3%（44/60）（图5），MSP 法检测癌组织、癌旁组织及 HCC 患者血浆RASSF1A 基因甲基化结果示意见图6；对照肝脏海绵状血管瘤患者肝组织及血浆 RASSF1A 未检测到基因启动子区域的甲基化；RASSF1A 甲基化率癌组织与癌旁组织比较有统计学意义（P ＜ 0.05），癌组织与 HCC 患者血浆比较差异无统计学意义（P ＞0.05），癌旁组织与 HCC 患者血浆比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；癌组织与 HCC 患者血浆中的甲基化发生率呈正相关，相关系数为 r = 1（P = 0.003）。

2.2甲基化与各临床资料的关系

本组病例血浆中 p16、RASSF1A 基因甲基化发生率与患者性别、年龄、肝硬化、肿瘤大小、AFP 水平等临床资料无统计学相关性（表2）。癌组织中p16、RASSF1A 基因甲基化发生率与各临床资料也无相关性（表3）。

M：甲基化引物扩增条带；U：非甲基化引物扩增条带；T：癌组织；P：血浆M： Methylated； U： Unmethylated； T： Tumor tissues； P： Plasma图6　肝癌组织（T1 ～ T4）和肝癌患者血浆（P1 ～ P4）RASSF1A 甲基化情况Figure 6　The methylated status of RASSF1A in tumor tissues （T1 - T4） and plasma （P1 - P4）

表2　HCC 患者血浆中 p16、RASSF1A 基因甲基化与临床参数的关系Table 2　The correlation between HCC and plasma’s p16 and RASSF1A methylation and the clinicopathological parameters

2.3p16 基因和 RASSF1A 基因联合检测及 AFP与基因甲基化检出率的关系

HCC 患者血浆 p16 基因甲基化检出率为63.3%（38/60），RASSF1A 基因甲基化检出率为73.3%（44/60），两者联合甲基化检出率为 80% （48/60），高于两者各自的单项指标检出率，差异有统计学意义（P = 0.042）。60 例 HCC 患者中，AFP 阳性 41 例，AFP 阴性 19 例，AFP 阳性组和阴性组 p16 甲基化检出率分别为 95.1%（39/41）和 10.5%（2/19），RASSF1A 甲基化检出率分别为100%（41/41）和 15.8%（3/19），AFP 阳性组和阴性组 RASSF1A 基因、p16 基因甲基化检出率差异无统计学意义。60 例研究对象中 AFP 阳性率为68.3%（41/60）。AFP、p16 和 RASSF1A 基因项指标联合检出率同三者各自的单项指标检出率差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。

表3　HCC 患者肝癌组织中 p16、RASSF1A 基因甲基化与临床参数的关系Table 3　The correlation between HCC and tumor tissues’ p16 and RASSF1A methylation and the clinicopathological parameters

3　讨论

肝癌的病因至今尚不清楚，目前认为是 HBV感染、食物黄曲霉素污染、癌基因活化、抑癌基因失活等因素共同作用、逐渐积累的结果，其中抑癌基因的失活是一个重要机制［3］。有研究报道抑癌基因启动子甲基化是 HCC 发生中的一种早期、普遍事件［4］，对其的研究亦越来越受到关注。

DNA 甲基化主要发生在 DNA 的 CpG 岛，虽不能改变核苷酸序列，却能调控基因的转录，在基因的表达与调控、细胞增殖与分化等方面都发挥重要作用［5］。大量研究表明，DNA 甲基化可引起染色质结构改变，DNA 构象、稳定性及 DNA 与蛋白质作用方式发生改变，进而调控基因表达［6］，平时非甲基化的抑癌基因出现启动子区 CpG 岛甲基化可导致抑癌基因转录失活从而表达缺失。启动子区异常甲基化与肿瘤发生与发展密切相关，其会影响甲基化敏感的转录因子同启动子的结合，进而引起基因表达沉默［7］。由于 CpG 岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测［8］。

P16 又叫 MTS 1（multiple tumor suppressor 1）基因，是 1994 年美国冷泉港实验室 Kamb 等发现的抑癌基因，p16 蛋白通过与 cyclinD1 竞争结合细胞周期素依赖激酶 CDK4 而抑制 CDK4 的激酶活性，阻止细胞从 G1期进入 S 期，抑制细胞的无限增殖及恶性转化。其失活可导致细胞过度增殖，细胞周期加速，使 DNA 在未被修复前过早地进入 S 期，导致肿瘤发生［9］。p16 基因启动子区域的 CpG 岛异常甲基化在肿瘤发生组织增生和化生阶段就已出现，且该甲基化通过肿瘤患者血清标本即可检测［10］。RAS 相关区域家族 1A（RASSF1A）位于染色体 3p21.3 区，是由 Dammann 等［11］在2000 年克隆并命名的，功能研究显示其为抑癌基因，在正常组织中 RASFF1A 基因启动子区域很少发生甲基化，目前 RASSF1A 基因启动子区甲基化水平已经成为多种肿瘤诊断的一个重要生物学指标，在乳腺癌［12］、肾癌［13］、肺癌［13］和前列腺癌［14］等恶性肿瘤中均检测出该基因启动子区异常甲基化。

p16 和 RASSF1A 基因分属于两个不同的信号传导通路，本研究我们发现 p16 及 RASSF1A 基因在 HCC 组织的甲基化阳性率高于癌旁组织，差异有统计学意义，正常肝组织中未检测到 p16 及RASSF1A 基因异常甲基化，HCC 患者血浆中 p16 及 RASSF1A 较对照患者血浆甲基化率高，且HCC 患者血浆与肿瘤组织 p16 及 RASSF1A 甲基化有相关性，因此两者联合检测可能提高 HCC检出率（P = 0.042），提示 HCC 患者相对于正常对照血清中异常甲基化的游离 p16 及 RASSF1A基因与 HCC 发生有关，HCC 患者血清中 p16 及RASSF1A 基因甲基化可能是肿瘤形成的早期事件，血清 p16 及 RASSF1A 甲基化的检测有早期预示肿瘤的作用。本结果与 Zekri 等［15］研究结果相近但甲基化程度不同，原因可能为①该研究样本均取自HCV 病毒感染患者，探讨 HCV 病毒与甲基化的关系；②该研究与本研究人种不同，地域也存在一定差异，可能影响甲基化的特点。

本研究中血清 p16 及 RASSF1A 基因甲基化与性别、年龄、肝硬化、肿瘤大小、AFP 水平等临床病理资料未显示相关性，与何青芳等［16］报道结果一致，分析原因可能与我们收集病例数较少、AFP及甲基化检测方法的不同、肿瘤患者的地域性差异，以及患者合并不同肝脏疾病等其他临床病理相关因素有关。

众所周知，早期诊断对提高肿瘤治疗效果及改善预后意义重大，越来越多的研究表明，DNA 的甲基化异常和癌症的发生发展有着密切的关系。血浆 DNA 甲基化检测的优点在于方便及微创，对HCC 早期诊断、病情检测及预后评估有重要意义。本研究结果表明，p16、RASSF1A 基因在 HCC 患者血浆中的甲基化率分别为 68.3% 和 73.3%，HCC 患者血浆中 p16 和 RASSF1A 基因甲基化测定可能对 HCC 的筛查有一定预示作用，两者联合检测的阳性率达 80%，因此，两者联合检测可能提高 HCC 检出率，我们认为对 HCC 发生的高风险人群进行基因甲基化监测可能有助于 HCC 的早期诊断，且可作为肿瘤筛查的分子生物标志物进一步研究，对确诊的 HCC 患者可能有助于监测病情变化和预测肿瘤复发。

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Author Affiliation：Departments of Hepatobiliary Surgery （DONG Xiao-gang， DING Wei）， Cancer Research Institute （GUO Wen-jia）， Affiliated Cancer Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（3）：252-258

·协会之窗·

Detection of methylation of p16 and RASSF1A gene in plasma and tumor tissues from patients with hepatocellular carcinoma and its clinical significance

DONG Xiao-gang， GUO Wen-jia， DING Wei

【Abstract】

ObjectiveTo detect aberrant methylation in the promoter of p16 and RASSF1A genes in peripheral plasma and tumor tissues from patients with hepatocellular carcinoma （HCC） and to discuss its clinical significance.

MethodsThe methylation status of p16 and RASSF1A genes in peripheral plasma and tumor tissues from 60 patients with HCC and adjacent noncancerous tissues were detected by methylation specific polymerase chain reaction （MSP）， and 60 normal liver tissues and plasma served as controls. Correlation between methylation status and clinicopathological features was analyzed.

ResultsThe rates of promoter methylation of p16 gene in the plasma， HCC and adjacent noncancerous tissues of 60 patients were 68.3% （41/60）， 63.3 % （38/60） and 41.7 % （25/60）， respectively， while the rates of promoter methylation of RASSF1A gene from above samples were 73.3% （44/60）， 70.0% （42/60） and 36.7% （22/60）， respectively. No methylated p16 or RASSF1A promoter was detected in normal liver tissues and plasma （P = 0.000）. No correlation was found between p16 and RASSF1A methylation status in HCC and plasma and the clinicopathological parameters， such as age， sex， cirrhosis， HBV， AFP， tumor size， tumor capsular， portal vein tumor embolus or pathological grades.

ConclusionAberrant promoter methylation of RASSF1A and p16 can be detected in plasma DNA among HCC patients. This detection is valuable as a potential biomarker for HCC.

【Key words】Carcimona， hepatocellular；p16 gene；RASSF1A gene；Promoter methylation；Plasma

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.010

基金项目：新疆医科大学附属肿瘤医院启动基金肿（2014-13）

通信作者：丁伟，Email：dingwei2@medmail.com.cn

收稿日期：2015-10-27

Corresponding Author:DING Wei， Email： dingwei2@medmail.com.cn