玻璃化冷冻法保存兔腰椎间盘的实验研究

胡成栋，刘曦，李盼，周玉军，陈怀志，郭全义



玻璃化冷冻法保存兔腰椎间盘的实验研究

胡成栋，刘曦，李盼，周玉军，陈怀志，郭全义

【摘要】

目的观察玻璃化冷冻法保存兔腰椎间盘的效果。

方法选取 30 只新西兰大耳白兔，随机分为玻璃化冷冻组、常规低温冷冻组和新鲜髓核细胞组，每组 10 只，将取下的腰椎间盘标本通过玻璃化冷冻法与常规低温冷冻法分别冻存 30 d，复温洗脱后，利用 MTT 比色法测量两组腰椎间盘纤维环及髓核细胞的相对活性，利用台盼蓝拒染法检测其细胞存活率。

结果MTT 比色法和台盼蓝拒染法所得结果基本一致，玻璃化冷冻组和常规低温冷冻组兔腰椎间盘髓核细胞存活率和相对活性均低于新鲜髓核细胞组，玻璃化冷冻组的兔腰椎间盘髓核细胞存活率和相对活性均优于常规低温冷冻组，其差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。

结论玻璃化冷冻法保存兔腰椎间盘髓核细胞存活率及细胞活性高，保存效果优于常规低温冷冻法。

【关键词】玻璃化作用；低温保存；椎间盘

作者单位：056001 河北省邯郸市中心医院骨二科（胡成栋、李盼、周玉军、陈怀志），免疫科（刘曦）；100039 北京，中国人民解放军总医院骨科研究所（郭全义）

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术, 2016, 11(3):247-251

目前临床上经常用传统低温冷冻法保存腰椎间盘，但该法常导致细胞内外形成冰晶，由于冻融效应造成细胞损伤，腰椎间盘细胞存活率和活性下降，从而导致其应用受到限制［1］。玻璃化冷冻法采用高浓度溶液单步骤快速降温，溶液转变为玻璃样无定形体，组织在保存过程中细胞内外不形成结晶，避免了细胞结构的破坏，有效保留了细胞的活性［2-4］。目前国内外已成功应用玻璃化法进行了多种细胞的保存（如卵母细胞、精子、成骨细胞、胚胎干细胞等），对组织玻璃化保存的研究也逐渐完善（如皮肤、胰腺、神经、血管、角膜、心脏瓣膜、肾脏、软骨、肌腱等）。然而玻璃化法保存椎间盘的研究在国内外文献中尚未见报道。作者在此基础上，探索玻璃化法保存腰椎间盘的可行性，观察保存效果并对玻璃化法保存兔腰椎间盘的实验结果进行分析。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物4 ～ 5 个月龄新西兰大白兔30 只，由河北医科大学实验动物中心提供，清洁级，动物编号：1412033，雌雄各半，重量为 2.5 ～3.0 kg。实验于 2013 年 4 月 - 2014 年 4 月在河北省邯郸市中心医院中心实验室完成。

1.1.2仪器及试剂WKL 型微机程控降温仪为北京欧科利技术发展有限公司产品；MDF-C2156VANX 型深低温冰箱为日本 Sanyo 公司产品；D1008 型液氮保存罐为美国 Scilogex 公司产品；M-W-0081 型显微手术器械为北京中兴名业科技发展有限公司产品；BX51 型手术显微镜为日本 Olympus 公司产品。二甲基亚砜、乙酰胺、蔗糖均购自北京化学试剂有限公司；0.25% 胰蛋白酶、0.2% II 型胶原酶均购自德国 Serva 公司。

1.2方法

1.2.1实验分组随机分为玻璃化冷冻组（实验组），常规低温冷冻组（对照组），新鲜髓核细胞组（空白对照组），每组 10 只。安乐死后无菌条件下切取兔腰 1 至骶 1 共 5 个椎间盘组织，去除纤维环及交界区组织，将分离出的髓核组织用于实验。

1.2.2常规低温冷冻组保存方法将腰椎间盘髓核组织样本由常温状态浸入主要由 2.0 mmol/L 二甲基亚砜组成的 4 ℃ 冷冻液，利用微机程控降温仪以 5 ℃/min 速率逐渐降温至 -80 ℃，深低温平衡 30 min，迅速投入液氮中保存。5、10、15、20、30 d 后分别将样本取出，37 ℃ 水浴复温（速率约100 ℃/min）30 s，用蔗糖 D-Hank′s 平衡液洗脱。

1.2.3玻璃化冷冻保存方法以二甲基亚砜和乙酰胺为基础液，DMEM-F-12 细胞培养液为溶剂配制成二甲基亚砜和乙酰胺浓度均为 3.5 mmol/L 的玻璃化溶液，将样本在 4 ℃ 经 3 个浓度梯度（25%、50%、75%）玻璃化溶液浸泡平衡处理，每浓度梯度平衡 15 min，转入 100% 玻璃化溶液中平衡 30 min，然后迅速投入液氮中保存。5、10、15、20、30 d 后分别取出样本，37 ℃ 水浴复温（速率约 100 ℃/min）30 s 后，经 3 个浓度梯度（75%、50%、25%）的玻璃化溶液洗脱后再用蔗糖D-Hank′s 平衡液洗脱。

1.2.4细胞收集将两种方法保存的腰椎间盘髓核样本用 PBS 溶液涮洗 3 遍后移至盛有浓度为0.2% 的 II 型胶原酶中，剪碎为 1 mm3的组织块，放入磁力转子在 37 ℃，5% CO2的培养箱中消化 40 min。消化后的混悬液以 1700 r/min 离心5 min，弃上清液后加入 0.25% 胰蛋白酶，再次放入培养箱中消化 20 min，加入含 10% 血清的DMEM-F-12 培养液停止消化，离心弃上清液后将原代细胞以 3 × 104个/cm2密度接种于 96 孔培养板中。

1.3观察指标

1.3.1MTT 比色法检测细胞相对活性将原代细胞接种于 96 孔培养板后，将其置于 37 ℃，5% CO2培养箱内，48 h 后首次换液，之后隔天换液，当细胞生长到 80% ～ 90% 融合时，在培养板的各孔中加入 20 μl MTT 溶液（5 mg/ml），继续培养4 h，加入 150 μl 二甲基亚砜，振荡 10 min 以使晶体溶解充分。在酶联免疫检测仪上测定各孔在波长为 490 nm 处的吸光度值。

1.3.2台盼蓝法检测细胞存活率取髓核原代细胞悬液 0.5 ml 加入 20 ml 试管中，加入 0.5 ml 0.4% 台盼蓝染液染色 2 ～ 3 min，吸取适量悬液涂于载玻片上，加上盖玻片。利用血球计数板在倒置显微镜下计数蓝染的死细胞及不染色的活细胞，计算髓核细胞存活率。计算公式为：回收率（%）=（洗脱后的细胞数/冻存前的细胞数）× 100%；存活率（%）=（洗脱后的细胞数/洗脱前的细胞数）× 100%。

1.4统计学处理

采用 SPSS17.0 软件进行统计学分析和处理，计量资料采用±s 表示，组间差异采用 t 检验，以 P ＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1兔腰椎间盘组织取材后情况

兔腰椎间盘纵轴长为（1.2 ± 0.11）cm，横轴长（0.5 ± 0.06）cm（图1），椎间盘取材后需要立即用注射器抽取生理盐水反复冲洗终板，以防止血液凝固后影响冻存试剂的渗透，影响冻存效果。

图1　取材后的兔椎间盘组织Figure 1　The rabbit intervertebral disc after operation

2.2MTT 比色法检测髓核细胞相对活性

实验中用酶联免疫检测仪在 490 nm 波长处测定 96 孔板中各组的吸光值，可间接测量活细胞数量，玻璃化冷冻组和常规低温冷冻组兔腰椎间盘髓核细胞相对活性均低于新鲜髓核细胞组，而玻璃化冷冻组髓核细胞相对活性高于常规低温冷冻组，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05），随着冻存时间的延长，常规低温冷冻组髓核细胞相对活性逐渐下降，而玻璃化冷冻组髓核细胞活性基本不变（图2）。

图2　MTT 比色法检测两组兔腰椎间盘髓核细胞相对活性Figure 2　Relative activity of rabbit lumbar nucleus pulposus cells was tested by MTT assay

2.3台盼蓝拒染法检测髓核细胞存活率

所有兔髓核细胞中，死细胞可被台盼蓝染成蓝色，活细胞拒染。显微镜下计数蓝染的死细胞及未着色的活细胞，统计分析后得出玻璃化冷冻组兔腰椎间盘髓核细胞存活率均低于新鲜髓核细胞组，而玻璃化冷冻组髓核细胞存活率高于常规低温冷冻组，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05），随着冻存时间延长，常规低温冷冻组髓核细胞存活率逐渐下降，而玻璃化冷冻组髓核细胞存活率基本不变（图3），台盼蓝拒染法和 MTT 比色法所测得结果基本一致。

图3　台盼蓝拒染法检测兔腰椎间盘髓核细胞存活率Figure 3　The viability of rabbit lumbar nucleus pulposus cells was tested by typan blue assay

3　讨论

腰椎间盘位于两个椎体之间，由周围纤维环、中心髓核和上下软骨终板三部分构成。目前临床上腰椎间盘退变导致腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄、退变性腰椎滑脱、节段性腰椎不稳定等疾病逐渐增多，严重影响着人们的生活质量［5］。现在，治疗严重椎间盘退行性病变常用的治疗方法为椎体融合，但是椎体融合后限制相应节段脊柱的活动，使邻近节段脊柱活动增加，从而加速了邻近节段椎间盘退变［6］，人工椎间盘置换可保留相应节段脊柱的运动，但是其可使脊柱运动方式发生永久性改变，可导致相邻节段椎体压力增加以及不稳，同样可加速邻近节段椎间盘退变［7］，并且存在假体松动，下沉，磨损，自发融合等一系列问题［8］。随着基础医学的发展，同种异体腰椎间盘移植成为治疗腰椎间盘退变的一个理想方法，阮迪克等研究同种异体椎间盘移植系列动物试验及临床手术，初步应用均取得了满意效果，并对多名椎间盘移植治疗的患者进行 5 年随访，随访结果也非常满意［9-10］。然而，由于同种异体椎间盘的供体少、保存时间、尺寸匹配、传染性疾病等原因严重限制了其在临床上的推广与应用。因此，研究椎间盘的长期保存方法，将有助于建立椎间盘组织库，进而可促进同种异体椎间盘移植治疗方法在临床上的开展。目前，保存椎间盘常采用慢速冷冻法，该法易使椎间盘细胞内外形成冰晶，导致细胞脂质膜及细胞结构损伤，复温后椎间盘细胞存活率和活性下降，且其操作复杂繁琐，导致其在椎间盘移植中的应用受到限制。本实验旨在探讨玻璃化冷冻保存腰椎间盘的可行性，并分析其保存效果，为椎间盘移植技术的应用提供理想的组织保存方法。玻璃化保存方法已成功用于胚胎、肌腱、胰岛、组织工程骨、关节软骨等多种组织的保存，并取得了理想的效果，但采用此方法保存腰椎间盘尚未见报道。

玻璃化法指采用高浓度溶液单步骤快速降温，使物质由液态转变为介于液态和固态之间的非结晶高黏稠状态（玻璃样无定形体），冷冻过程无相变，物质连续固化形成玻璃态，细胞内外不形成结晶或仅少量结晶，玻璃态物质的分子间关系与液态相比无明显改变，无细胞结构破坏，细胞活性得到了较好保存［4， 11-12］。玻璃化溶液常由渗透性低温保护剂、小分子糖类、高分子聚合物 3 种成分组成。常用的渗透性低温保护剂为二甲基亚砜。高分子聚合物包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖、葡聚糖等，可通过降低细胞外所需的渗透性低温保护剂的浓度来减轻对细胞的毒性［13］。小分子糖类如葡萄糖、蔗糖等，无细胞毒性，但有较强的渗透效应，可以使细胞脱水，从而降低细胞内渗透性低温保护剂的浓度，减轻细胞肿胀［14］。玻璃化法比传统的低温冷冻法所用的冷冻保护剂浓度大很多，冷冻保护剂的浓度越高，毒性也就越大。本试验对冷冻保护剂进行了合理配置，兼顾强穿透性和强玻璃化能力，又降低了保护剂的毒性，使其玻璃化效果达到了最好。我们选择了低毒性的冷冻保护剂二甲基亚砜，并且在玻璃化冷冻开始之前应用四步平衡法从低浓度向高浓度建立渗透梯度，使冷冻保护剂均匀缓慢地渗入细胞，严格控制每个步骤的平衡时间，使细胞内的溶液浓度达到玻璃化的要求。复温后采用蔗糖 D-Hank′s 平衡液代替等渗溶液对椎间盘髓核组织进行洗脱，这样既可防止水分子快速渗入细胞导致细胞崩解，又可加速冷冻保护剂从细胞内排出，减轻保护剂对细胞的毒性损伤。

MTT 比色法和台盼蓝拒染法检测髓核细胞相对活性和细胞存活率，玻璃化冷冻组和常规低温冷冻组兔腰椎间盘髓核细胞相对活性和细胞存活率均低于新鲜髓核细胞组，而玻璃化冷冻组髓核细胞相对活性和细胞存活率高于常规低温冷冻组，随着冻存时间的延长，常规低温冷冻组髓核细胞相对活性和细胞存活率逐渐下降，而玻璃化冷冻组基本不变。由此我们可以得知，玻璃化法冻存兔椎间盘组织过程中细胞存活率和相对活性不随冻存时间延长而下降，冻存效果优于常规低温冷冻法，冻存效果比较理想，可用于长期保存组织、细胞或器官，但是移植效果需进一步体内实验验证。寻找对兔腰椎间盘组织和细胞毒性较小的玻璃化溶液配比方案和优化腰椎间盘玻璃化低温保存程序，并观察玻璃化保存后的移植效果是本研究下一步的重点。

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ObjectivesTo observe the effect of preservation of the rabbit intervertebral disc by vitrification.

MethodsThirty New Zealand white rabbits were randomly divided into vitrification preservation group， cryopreservation group and fresh nucleus pulposus cells group， with ten rabbits in each group. The specimens of the lumbar intervertebral disc were frozen by vitrification or cryopreservation respectively for 30 d. Then， the complex was removed from storage and rapidly thawed in a 37 ℃shaking water bath. MTT colorimetric method was used to measure the relative activity of two groups of lumbar intervertebral disc annulus and nucleus pulposus cells， and cell survival rate was detected by using the method of the trypan blue dye exclusion assay.

ResultsThe final results of MTT colorimetric method were basically in agreement with the results of trypan blue dye exclusion assay. The survival rate and relative activity of the rabbit lumbar disc nucleus pulposus cells in the vitrification preservation group and cryopreservation group were less than those in the fresh nucleus pulposus cells group. The survival rate and relative activity of the rabbit lumbar disc nucleus pulposus cells in the vitrification preservation group were better than those in the cryopreservation group， and the difference was statistically significant （P ＜ 0.05）.

ConclusionThe intervertebral disc preserved by vitrification had higher survival rate and better activity than the cryopreservation group.

【Key words】 Vitrification；Cryopreservation；Intervertebral disc

Author Affiliations: The Second Department of Orthopedics （HU Cheng-dong， LI Pan， ZHOU Yu-jun， CHEN Huai-zhi），Department of Rheumatology （LIU Xi）， Handan Central Hospital， Hebei 056001， China； Institute of Orthopedics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100039， China （GUO Quan-yi）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):247-251

An experimental study on the vitrification preservation of rabbit intervertebral disc

HU Cheng-dong， LIU Xi， LI Pan， ZHOU Yu-jun， CHEN Huai-zhi， GUO Quan-yi

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.009

基金项目：河北省邯郸市科学技术研究与发展计划项目（0928108052）

通信作者：胡成栋，Email：hcd111111@163.com

收稿日期：2015-12-18

Corresponding Author:HU Cheng-dong， Email： hcd111111@163.com