HPLC法测定枸橼酸坦度螺酮片含量和有关物质

李 婧，何黎黎，仇丽颖，李佳川(西南民族大学，四川 成都 610041)

HPLC法测定枸橼酸坦度螺酮片含量和有关物质

李 婧，何黎黎，仇丽颖，李佳川
(西南民族大学，四川 成都 610041)

摘 要：采用高效液相色谱法，用Luna C18柱(250×4.6mm，10μm)，以乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液(35：65，pH3.0)为流动相，流速：1ml/ min，柱温：25℃，进样量20μL，检测波长：239nm.在该色谱条件下枸橼酸坦度螺酮和杂质峰达到良好分离(R＞1.5)，枸橼酸坦度螺酮在1.0～200.0μg·ml-1范围内线性关系良好(r = 0.9991)；重复性及精密度良好(RSD＜2%)，3种浓度的平均回收率分别为100.17%、99.03%及99.75% (n =3).方法快速、简便、准确，适用于枸橼酸坦度螺酮片的含量测定和有关物质检查.

关键词：高效液相色谱法；枸橼酸坦度螺酮；含量测定

随着生活节奏的加快，焦虑的发生率日益增加.新一代抗焦虑药枸橼酸坦度螺酮(图1)属于氮杂螺酮(azapirone)类药物，是一种5-HT受体激动剂，通过激动5-HT1A的自身受体，从而调节中缝核投射到海马区的5-HT，进而抑制行动抑制系统中的5-HT效应，发挥抗焦虑作用[1-3].本品由日本住友制药株式会社研制，1996年首次于日本上市.坦度螺酮适应范围较广，对恐怖、抑郁、焦虑、烦躁和睡眠障碍等精神症状有效[4-8].坦度螺酮不良反应少，安全性高，适宜长期使用.但对于心功能、肝肾功能、呼吸功能不全及器质性脑功能障碍者慎用[9-13].目前国外对坦度螺酮含量测定及有关物质有一定研究，但报道较少，实验条件苛刻，本研究建立了高效液相色谱法测定坦度螺酮片，该法简便、准确，适用于坦度螺酮片的质量控制.

图1　枸橼酸坦度螺酮的结构式Fig.1 Structure formula of citrate tandospirone

1　材料与仪器

1.1 仪器

日本岛津LC-10ATvp型高效液相色谱仪;色谱柱为Luna C18柱(250×4.6mm，10μm);Milli-Q Academic超纯水仪，赛多利斯BS224S万分之一电子天平.

1.2 材料

枸橼酸坦度螺酮普通片(规格:10mg，批号: 150912)由四川大学华西药学院药剂教研室研制.乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)，实验用水为重蒸馏水，其余试剂均采用分析纯.

2　方法及结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱采用Luna C18柱(250×4.6mm，10μm);流速:1ml/ min，柱温:30℃;进样量20μL.流动相:乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液(35:65，调PH至3.0)，检测波长:239nm.理论塔板数按照枸橼酸坦度螺酮峰计算应不低于5000，枸橼酸坦度螺酮峰与相邻杂质峰分离度应不低于1.5.

2.2 含量测定

2.2.1 溶液的配制

对照品溶液配制:取枸橼酸坦度螺酮标准对照品适量，加流动相溶解，制成每1ml含枸橼酸坦度螺酮10μg的溶液，作为对照品溶液.

供试品溶液配制:取本品10片，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮1mg的细粉适量，置于100ml容量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液.

2.2.2 含量测定

取对照品及供试品溶液各20μl进样，记录色谱峰面积，按照外标法计算供试品枸橼酸坦度螺酮的含量.

2.3 方法验证

2.3.1 分析方法专属性试验

对空白辅料溶液、照品溶液及供试品溶液进行考察，HPLC色谱图见图2.结果表明流动相及空白辅料不干扰枸橼酸坦度螺酮的测定.

2.3.2 精密度试验

在“2.1”项的色谱条件下，在同日内对同一样品测定6次，枸橼酸坦度螺酮的日内RSD为0.38%，表明精密度良好.

2.3.3 重复性试验

分别取三批样品，于“2.1”项的色谱条件下，在不同日期进行含量测定，枸橼酸坦度螺酮的日间RSD分别为0.78%、0.59%、0.92%，表明重复性良好.

2.3.4 溶液稳定性试验

室温(25℃)条件下，取“2.2.1”项下供试品溶液溶液放置0、1、4、10、20小时，在“2.1”项的色谱条件下测定，结果枸橼酸坦度螺酮片含量的RSD为0.86%.结果表明样品溶液在室温(25℃)条件下20小时内稳定.

2.3.5 线性关系检测限及定量限

取枸橼酸坦度螺酮对照品，分别制成浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、100.0、200μg·ml-1的溶液，分别进样20μl，记录峰面积.以枸橼酸坦度螺酮峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程为: y =29827x - 5213.6(r =0.9991)，表明枸橼酸坦度螺酮浓度与峰面积在1.0～200.0μg·ml-1范围内线性关系良好.取枸橼酸坦度螺酮原料药用流动相稀释成不同浓度溶液.测定主峰峰高及相同条件下的色谱基线噪声，以信噪比3:1作为检测限，以信噪比10:1作为定量限.枸橼酸坦度螺酮检测限为0.60 ng，定量限为1.85 ng.

2.3.6 回收率试验

精密称取枸橼酸坦度螺酮对照品按处方比例加入辅料，用流动相制成低、中、高三种浓度溶液(8.0、10.0和12.0μg·ml-1)，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，按照外标法计算，平均回收率分别为100.17%、99.03%及99.75%，RSD分别为2.01%、1.82%及1.36%(n =3).

2.4 含量测定结果

取3批样品，照“2.2.1”色谱条件及“2.2.2”项下方法进行测定，记录峰面积，按外标法计算含量.含量测定结果见表1.

2.5 有关物质检查

2.5.1 有关物质测定法

取本品10片，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置于100ml容量瓶中，用流动相稀释溶解至刻度，滤过后取续滤液，作为供试品溶液;精密量取上述供试品溶液1ml，于100ml容量瓶加流动相稀释100倍，作为对照溶液.取供试品溶液，进样20μl，色谱图时间保留至主峰出峰的2倍时间;另取对照溶液进样20μl，检测灵敏度调节至主峰峰高约为满量程的10-20%.记录供试品溶液HPLC色谱图中各杂质峰面积，杂质峰面积之和不得大于对照液主峰面积的1倍(1%).单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍(0.5%).

2.5.2 强制降解试验

氧化试验:取样品碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，加过氧化氢溶液10 mL，室温放置1小时后，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3 (A).

碱解试验:取样品碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，加10ml 0.1mol·ml-1氢氧化钠放置2 h，用盐酸中和至中性，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(B).

酸解试验:取样品碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，加10 ml 0.1mol·ml-1盐酸放置2小时，用氢氧化钠中和至中性，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(C).

高湿试验:取样品10片，RH90%的湿度下放置10天，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(D).

高温试验:取样品10片，在60(C时加热10天，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(E).

强光试验:取样品10片，在强光(照射度为4500 ±500LX)下，照射3天，碾碎，精密称取约相当于枸橼酸坦度螺酮10mg的细粉适量，置100mL量瓶中，用流动溶解稀释至刻度，滤过，取续滤液进样20μl，色谱图见图3(F).

按照“2.5.1”项下方法试验.试验结果表明，本品对氧化、酸、碱较为敏感.图谱显示，各降解试验产生的杂质均能与主成分产生较好分离(分离度大于1.5).说明本研究所建方法专属性较强.

图3　破坏性试验色谱图(A)氧化破坏样品;(B)碱破坏样品;(C)酸破坏样品;(D)高湿度破坏样品;(E)高温破坏样品;(F)强光破坏样品Fig.3 Chromatograms of degradation products (A)sample in H2O2solution(B)sample in alkali solution (C)sample in acid solution(D)sample in high humidity(E)sample after being heated(F)sample after being lighted

2.5.3 重复性试验

按“2.5.1”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定，以杂质含量进行方法的精密度考察，结果总杂质RSD为0.86%，最大单一杂质RSD为1.23%，表明本方法重复性较好.

2.5.4 有关物质测定结果

按照2.5.1项下方法，分别对三批样品有关物质进行检查，检测结果见表1.

表1　3批样品含量测定和有关物质检查结果(n =3)Table 1 Content and related substance of Citrate Tandospirone tablets in 3 batches(n =3)

3　讨论

资料研究表明枸橼酸坦度螺酮片虽然安全性较好，但对过敏及肝肾功能不全者慎用[14 -15]，所以应对合成过程中产生的有关物质进行控制.由稳定性试验和破坏性试验可知，在氧化、酸及碱性条件下杂质会增多，根据枸橼酸坦度螺酮的生产工艺情况，本研究限定了本产品的最大单一杂质及杂质总量.对本品降解产物的研究还需进一步研究，以更好控制本品的质量.

波长选择中用甲醇降枸橼酸坦度螺酮对照品溶解制成10μg.ml-1的溶液，进行紫外扫描(200～400nm).结果枸橼酸坦度螺酮在波长239nm处有最大吸收值，在该波长处空白辅料流动相溶液不干扰样品的测定，所以采用239nm为测定波长.

中国药典2015年版未收载枸橼酸坦度螺酮质量标准，本研究可以为坦度螺酮的质量控制提供参考.

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(责任编辑：李建忠，付强，张阳，罗敏；英文编辑：周序林，郑玉才)

Determination of contents and related substance in citrate tandospirone tablets by HPLC

LI Jing，HE Li-li，QIU Li-ying，LI Jia-chuan
(Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.)

Abstract:A HPLC method was employed in this study using a Luna C18column(250×4.6mm，10μm)，and the mobile phase was acetonitrile :0.1 mol·L-1KH2PO4buffer solution(35:65，pH 3.0).The flow rate was 1.0 mL·min-1，the column temperature was 30°C and the UV detection was set at 239 nm.Under this condition，Tandospirone tablets were separated with its related substances thoroughly(R＞1.5).The calibrated linear curve of tandospirone was within 1.0 μg·ml-1to 200.0μg·ml-1(r =0.9991).The precision and reproducibility of the method were good(RSD＜2%).The recovery rates for three concentrations were 100.17%，99.03% and 99.75%(n =3)，respectively.This method is quick，simple and effective，and is suitable for the determination of citrate tandospirone content and related substance in the tablets.

Key words:HPLC;citrate tandospirone;content

中图分类号：O657.7；R917

文献标志码：A

文章编号：2095-4271(2016)02-0183-05

doi:10.11920/ xnmdzk.2016.02.010

收稿日期：2016-01-08

作者简介：李婧(1985 - )，女，汉族，四川人，实验师，研究方向:药品质量控制与药物代谢.E-mail:27918716@ qq.com.