新疆枸杞种质资源遗传多样性的SRAP分析

查美琴，赵玉玲，李　疆*，朱　瑜，罗淑萍，胡　月

新疆枸杞种质资源遗传多样性的SRAP分析

查美琴1，赵玉玲2，李疆1*，朱瑜1，罗淑萍1，胡月1

(1新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052;2.新疆精河县枸杞管理中心, 新疆精河 833300)

摘要:利用SRAP分子标记技术对新疆枸杞种质资源遗传多样性及亲缘关系进行研究，为新疆枸杞种质资源分类和杂交育种提供理论依据。结果显示：(1)筛选出的12对SRAP引物共扩增出310个位点，其中多态性位点264个，多态性比率平均为84.61%，引物多态性信息含量(PIC)变化范围为0.76～0.93，平均为0.83；观测等位基因(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、Shannon信息指数(I)平均值分别为1.846 1、1.386 9、0.228 0和0.352 0。(2)聚类分析表明，供试材料间的遗传相似系数为0.590 3～0.903 2，在遗传相似性系数为0.70和0.76时，可将30份样品分别分为2大类和5个亚类；主坐标分析结果和聚类结果基本一致。研究表明，新疆枸杞种质资源遗传多样性较丰富，且野生种与栽培品种 (系)间的遗传差异较大，表现出较远的亲缘关系，而栽培品种(系)间的遗传差异相对较小，表现出较近的亲缘关系。

关键词:枸杞；相关序列扩增多态性(SRAP)；聚类分析；主坐标分析；遗传多样性

枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科(Solanaceae)枸杞属(LyciumL.)的一种多年生落叶灌木[1]。枸杞作为一种药食同源植物，具有抗肿瘤、软化血管、防衰老及增强免疫力等药理作用[2]。全球枸杞属植物约有80多种，多分布在南美洲南部和北美洲西南部，少数分布于欧亚大陆的温带[3]，中国野生自然分布的有7种和3变种，主要分布于西北和华北[4]，新疆作为中国枸杞主产区之一[5]，拥有的种质资源十分丰富。因枸杞属于常异花授粉植物，多数自交不亲和，基因型高度杂合，种子繁育后代容易发生性状分离，通过营养繁殖方式培育出的无性系新品种(系)在形态上极为接近[6]，加之基因组信息研究薄弱，使得遗传信息缺乏，遗传关系模糊不清[7]，优良种质的特性难以在品种(系)间杂交被有效遗传利用[8]。因此，从DNA水平研究新疆枸杞种质资源的遗传多样性，对枸杞种质资源分类、有效利用及优良品种选育具有重要意义。相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)是Li等开发的一种针对外显子区域进行扩增的新型分子标记技术[9]，克服了RAPD、RFLP、AFLP等标记技术的一些局限性，具有技术简便、高效、重复性好、多态性明显等优点。目前已成功应用于植物种质资源遗传多样性和亲缘关系分析、图谱构建、核心种质库的构建、种质鉴定等方面研究，如中国灌木辣椒[10]、不结球白菜[11]、山药[12]、南瓜[13]等。近年来，国内外学者对枸杞种质资源遗传多样性的研究主要侧重于形态分类学[14]、染色体核型分析[15]、同工酶水平[16]等方面，后来，随着分子生物学的快速发展，分子标记技术成为枸杞种质资源遗传多样性研究主要技术手段之一，已有基于PCR的RAPD[17]、ISSR[18]、SSR[19]、SRAP[20]等标记技术的枸杞种质资源遗传多样性分析。传统的枸杞种质资源遗传多样性研究方法具有一定的局限性，分子标记直接反映基因组DNA的遗传变异信息，且该技术的种类日趋完善，检测范围日趋扩大，但目前利用SRAP标记技术针对新疆枸杞种质资源遗传多样性方面的分析鲜见报道,尤其在分子水平上的研究报道甚少。 本试验以新疆枸杞种质资源圃栽培品种(系)和野生种共30份样品为试材，拟采用SRAP标记技术对其遗传多样性进行分析，旨在从分子水平上确定新疆枸杞种质间遗传变异信息及亲缘关系，为新疆枸杞种质资源分类、保护和利用枸杞野生资源以及新品种选育提供分子生物学依据。

1材料和方法

1.1供试材料

该试验所用材料(表1)于2014年7月采自新疆精河县枸杞管理中心枸杞种质资源圃，共计30个样品，采摘一年生枝条上的鲜嫩叶片置于写好编号且放有变色硅胶的自封袋中，带回实验室，放室温下保存备用。

表1　试验材料编号及名称

表2　供试SRAP引物序列

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取与检测采用改良CTAB法提取供试材料基因组DNA[21]，用核酸蛋白仪检测DNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和纯度，EB染色后，凝胶成像系统观察并摄影记录，用ddH2O将DNA浓度稀释至50 ng/μL后分装,保存-40 ℃冰箱中备用。

1.2.2引物筛选所用SRAP正反向引物参照Li等公布的引物序列(表2)，由上海生工生物工程有限公司合成，SRAP正反向引物各12条，两两组合成144个引物组合，PCR反应相关试剂10×Buffer(含Mg2+)、TaqDNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNA marker和ddH2O均购自天根生化科技(北京)有限公司。从供试材料中抽取形态性状差异较大的枸杞DNA模板5个对144对SRAP引物进行筛选，最终筛选出清晰易辨认、稳定性好、多态性丰富的SRAP引物用于所有DNA样品扩增。

1.2.3PCR扩增PCR反应在Bio-Rad PCR仪上进行。在25 μL SRAP-PCR反应体系中，含10×Buffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，DNA模板(50 ng/μL)1 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL, 正反引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min反应5个循环, 94 ℃变性1 min,50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min反应35个循环,72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.4PCR扩增产物的检测PCR扩增产物与2 μL 6×Loading Buffer混匀后，在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电极缓冲液为1×TBE，200 V恒电压电泳约50 min，电泳结束后，银染法染色显影，在荧光灯上观察分析条带并照相记录，试验设定3个重复。

1.3数据的处理与分析

对清晰且易于辨认的谱带根据分子标记的迁移率及其有无，统计所有的二元数据，按条带有无赋值，同一位点有带记为“1”，无带记为“0”，建立二元原始数字矩阵；利用PIC_CALC Version 0.6软件计算多态信息含量(PIC)值；运用POPGENE1.32软件计算扩增产物的多态位点数、多态性百分率(PPB)、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)和Shannon信息指数(I)等遗传多样性参数；利用NTSYS-pc2.1e软件计算不同枸杞种质间的Jaccard相似性系数(GS)，按非加权成组配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析,通过Tree plot模块生成亲缘关系聚类图，最后，根据遗传相似系数进行主坐标分析及绘制三维空间图和二维平面散点图以检验聚类结果。

2结果与分析

2.1SRAP引物扩增结果分析

M. DL1500；编号1～30同表1图1　引物组合me4-em8对枸杞所有试材的SRAP扩增No. 1-30 are the same as Table 1Fig.1　SRAP amplification of Lycium barbarum L. germplasm by primer combination me4-em8

Table 3　The statistics of genetic diversity of L. barbarum

2.2遗传多样性分析

利用POPGENE1.32软件对30份枸杞样品扩增的310个位点进行分析，获得数据表明：观测等位基因(Na)介于1.592 6～2.000 0，平均为1.846 1；有效等位基因(Ne)介于1.205 6～1.528 5，平均为1.386 9；Nei′s基因多样性指数(H)介于0.134 0～0.305 5，平均为0.228 0；Shannon信息指数(I)介于0.224 5～0.457 8，平均为0.352 0。这些研究结果表明，新疆枸杞种质资源遗传差异较大，遗传多样性水平较高。

2.3遗传相似性分析

利用NTsys-pc2.10e软件计算SRAP引物产生的所有位点的遗传相似系数(GS)，30份枸杞样品两两间的遗传相似系数介于0.590 3～0.903 2之间，平均(GS)值为0.736 1;遗传相似系数最小的是‘野黑果枸杞’和‘宁杞5号’，相似系数为0.590 3，表明亲缘关系最远;遗传相似系数最大的是‘1101’和‘1102’，为0.903 2，表明亲缘关系最近。总体来说，30份枸杞样品间遗传相似系数较低，存在较高的遗传差异。

2.4聚类分析

基于30份枸杞样品间的遗传相似系数，用UPGMA法对30份枸杞样品进行聚类分析，获得亲缘关系聚类图(图2)，在遗传相似性系数为0.70时，可将供试材料分成2大类。第Ⅰ大类包括野红果枸杞、野黑果枸杞、野生雪青色果和野生黄果枸杞4个野生种，这说明4个野生种间遗传差异小，亲缘关系近，并以野生雪青色果和野生黄果枸杞之间的亲缘关系最近。在相似系数为0.76时，第Ⅱ大类又可细分为5个亚类。首先，大麻叶枸杞一个品种作为第ⅰ亚类；第ⅱ亚类是‘宁杞1号’和‘宁杞5号’2个品种聚在一起；第ⅲ亚类是‘蒙杞1号’和‘白刺枸杞’2个品种被分为一类；第ⅳ亚类包括‘精杞3号’、‘精杞5号’、0901、1016、1017和‘宁杞7号’，其中的‘精杞3号’和‘精杞5号’、1016和1017分别表现出遗传变异程度低、遗传背景相近的亲缘关系。第ⅴ亚类包括剩余的15个品种，其中，‘精杞1号’和‘精杞4号’、‘精杞8号’和1012、1407和‘宁菜1号’、1018和1021有较近的亲缘关系，1101、1102和1103被分为一小类，说明它们遗传基础狭窄，遗传变异小，父本或母本相同。

遗传相似性系数Genetic similarity coefficient 1～30材料编号同表1图2　30份枸杞种质的UPGMA聚类分析图No.1-30 are the same materials as Table 1Fig.2　UPGMA dendrogram for 30 resources of L. barbarum L. based on SRAP data

2.5主坐标分析

基于30份枸杞样品间的遗传相似性系数矩阵，利用NTSYS-pc2.10e软件进行主坐标分析,建立三维空间图(图3，A)和平面散点图(图3，B)，结果表明，第1、第2 和第3主坐标分别解释了11.67%、10.11%和7.76%的样本间相关性。将位置靠近者划分为一组，30份枸杞样品被分为2个大组(第Ⅰ、Ⅱ大组)，其中，4个野生种表现出较近亲缘关系被单独划分为第Ⅰ大组，剩余的26份枸杞样品作为第Ⅱ大组。根据供试材料在坐标图中的位置分布，第Ⅱ大组又可细分成Ⅴ个亚组。‘宁杞1号’和1104组成第ⅰ亚组，‘精杞4号’、‘精杞8号’、‘宁杞5号’和‘白刺枸杞’4个样品被聚为第ⅱ亚组，第ⅲ亚组包括‘精杞1号’、‘精杞3号’、‘精杞5号’、‘精杞7号’、0901、1012、1016、‘宁杞7号’和‘蒙杞1号’共9份栽培品种(系)；1017和1102聚在一起组成第ⅳ亚组；第ⅴ亚组包括1018、1021、1101、1103、1202、1407、‘宁菜1号’、‘柱筒枸杞’和‘大麻叶枸杞’共9份枸杞样品。与UPGMA法聚类结果相比，2种分析方法在栽培品种(系)间亲缘关系研究方面存在一点差异，如‘宁杞1号’和‘宁杞5号’在聚类图中明显被聚在一起，而主坐标分析图中却没有被划分在一组，可见，栽培品种(系)基因型复杂。比较图2和图3可知，两种方法的群组划分趋向一致，但组群内分析结果相似却并不完全相同，但主坐标分析能更直观地反映出30份枸杞样品的遗传变异和亲缘关系远近。

A．三维图； B．平面图；1～30材料编号表同1图3　枸杞各试材的SRAP标记主坐标分析图A.Three-dimensional graph；B.Planar graph；No.1-30 are the same materials as Table 1Fig.3　Principal coordinates analysis of Lycium bararum L. genotypes from SRAP markers

3讨论

3.1新疆枸杞种质资源的遗传多样性分析

DNA是生物的主要遗传物质，DNA水平上的遗传变异大小直接体现该物种在特定环境中遗传多样性水平的高低，只有了解种质资源DNA遗传变异信息及亲缘关系，才能有效并合理地利用物种的种质资源和有目的地进行品种选育中的亲本选配，从而培育出优良新品种[22]。本试验采用SRAP分子标记技术对30份枸杞样品进行遗传多样性分析，筛选出12对SRAP引物扩增出264个多态性位点，占84.61%，这充分表明新疆枸杞种质资源具有较为广泛的遗传基础。安魏等在枸杞种质资源的SRAP分析中多态性比率为76.68%[23]，尹跃在枸杞品种(系)分子鉴定及亲缘关系分析中多态性比率达87.7%[24]，和本试验的PPB值相当；多态信息含量(PIC)值大于0.5的标志基因具有高度信息，本试验平均每对引物的(PIC)值为0.83，属于高度多态性位点；有效等位基因和Nei’s基因多样性指数是目前遗传多样性研究中应用较为广泛的一个指数，而且，Nei’s基因多样性指数也是衡量物种遗传多样性的一个重要指标[25]，本试验供试样品Nei’s基因多样性指数(H)介于0.134 0～0.305 5，平均为0.228 0，反映了新疆枸杞种质资源具有较为丰富的基因型，这可能与其常异花授粉的生物学特性有关。另外，本研究遗传相似系数介于0.590 3～0.903 2之间，平均(GS)值为0.736 1，这也充分说明供试材料间遗传差异较大，SRAP标记可有效应用于新疆枸杞种质资源的亲缘关系分析。

汽轮机轴封间隙的调整是机组重要的检修内容，间隙调整的质量关系机组能效指标，同时也是涉及汽轮发电机组运行时振动安全的因素之一；文中介绍了不同类型的汽封特点，对应各机组实际情况，需做到合理选用汽封；另外，对汽封间隙的调整进行了说明，希望在汽封维护检修方面给大家带来一定的借鉴。

3.2聚类分析和主坐标分析

本试验采用UPGMA法聚类分析和主坐标分析两种方法对30份枸杞样品遗传多样性进行分析，两种分析方法均反映出供试的野生种与栽培品种(系)间的遗传差异较大，表现出较远的亲缘关系，而栽培品种(系)间的遗传差异相对较小，表现出较近的亲缘关系。一方面，这可能与UPGMA法聚类侧重于种质间关系差异的量化分析，提供丰富的数量信息，而主坐标分析则是从多个角度分析不同种质或群体间的关系有关[26]，两种方法不矛盾。另一方面，这可能与新疆枸杞种质资源在长期进化和人工选择过程有关，为保留种质的优良特性，栽培品种(系)种苗的繁育主要采用人工选育方式，如利用自然变异选择突变单株，然后通过实生、分株、硬枝和嫩枝扦插以及组织培养等方式扩大繁殖，从而使不同栽培品种(系)之间基因型类似且高度杂合，导致栽培品种(系)间产生了复杂的遗传关系，而野生种就地保存了大量的原始种质。从新疆枸杞种质资源遗传多样性研究的角度看，今后应进一步扩大分子标记技术应用的范围，筛选出更多适合于新疆枸杞种质资源遗传多样性分析的引物，从DNA水平上更加准确地反映出其种质间的遗传变异信息及亲缘关系远近，从新疆枸杞产业长远发展的角度来看，在以后的枸杞种苗的繁育过程中，应注重与不同基因型的野生种进行杂交亲本选配，不断增加基因型的聚合和优良基因型的选择几率，这对品种改良和优良品种选育具有较大的利用价值。从整体上看，这两种分析方法对种质资源进行遗传多样性分析是可行的，将两种方法结合起来使用能使结果更加形象直观，又更加全面，起到相互补充的作用。

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(编辑:宋亚珍)

Analysis of Genetic Diversity of Germplasm Resources ofLyciumbarbarumL.Revealed by SRAP in Xinjiang of China

ZHA Meiqin1, ZHAO Yulin2,LI Jiang1*, ZHU Yu1, LUO Shuping1, HU Yue1

(1. College of Forestry Science and Horticulture, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052,China;2.Management Center of Jinghe County Wolfberry , Jinghe, Xinjiang 833300 , China)

Abstract:SRAP markers were used to study the genetic diversity and phylogenetic relationship for providind a theoretical basis for identification and crossbreeding of genetic resources of Lycium barbarum L.in Xinjiang of China. The results are: (1)a total of 310 loci were produced by 12 pairs of SRAP primers, and polymorphic loci were 264 which accounted for 84.61% in the total amplified fragments. The polymorphism information content (PIC) values of these markers varied from 0.76 to 0.93 with an average of 0.83. Mean values of observed number of alleles(Na),effective number of alleles (Ne),Nei’s gene diversity (H) and Shannon’s information index(I) were 1.846 1, 1.386 9, 0.228 0 and 0.352 0.(2)Range of genetic similarity (GS) was 0.590 3 to 0.903 2 among 30 wolfberry samples. Cluster analysis showed that samples could be divided into 2 groups and 5 subgroups accordingly at the GS of 0.70 and 0.76. The principal coordinate analysis and clustering results are basically consistent. Research shows the genetic diversity of germplasm resources of L. barbarum L. in Xinjiang was relatively abundant. The genetic difference between wild species and cultivars (lines) was relatively large,show a distant relationship, and the genetic difference among cultivars (lines) was relatively small, show a close relationship.

Key words:Lycium barbarum L.；sequence-related amplified polymorphism (SRAP)；cluster analysis；principal coordinates analysis；genetic diversity；

文章编号:1000-4025(2016)04-0681-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0681

收稿日期:2015-10-12;修改稿收到日期:2016-03-24

基金项目:国家林业公益性行业科研专项(201304701-1)；新疆自治区果树学重点学科基金资助

作者简介:查美琴(1981-)，女，在读硕士研究生，主要从事林木生物技术研究。E-mail:zhamq2016@126.com *通信作者:李疆(1959-)，男，教授，博导，主要从事林木种质资源研究。E-mail：lijiangxj@163.com

中图分类号:Q346+.5

文献标志码:A