转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

于秀敏，张燕娜，岳文冉，杨　杞，万永青，李国婧，王瑞刚

(内蒙古农业大学 生命科学学院，呼和浩特 010018)

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

于秀敏，张燕娜，岳文冉，杨杞，万永青，李国婧，王瑞刚*

(内蒙古农业大学 生命科学学院，呼和浩特 010018)

摘要：该研究在实验室前期研究的基础上，将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥，并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系，比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率，以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现：(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下，转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型，随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加，各株系萌发率均降低，但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系，并且在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L甘露醇处理下，过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下，CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明，柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。

关键词：柠条锦鸡儿；胚胎晚期丰富蛋白基因；非生物胁迫；转基因拟南芥

胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins，LEA蛋白)因在胚胎发育晚期大量积累而得名，广泛存在于高等植物的种子中，在种子成熟脱水过程中起到保护组织细胞免受脱水伤害的作用，由Dure等[1]最早在胚胎发育后期的棉花子叶中发现。LEA蛋白是一类低分子量蛋白，分子量大多在10～30kD之间，富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等亲水性氨基酸，疏水性氨基酸含量较少，具有高度亲水性和热稳定性[2]。LEA蛋白并非植物所特有，在昆虫[3]、线虫[4]、细菌[5-6]等体内也发现了LEA蛋白的存在。

研究表明，LEA蛋白的表达无组织特异性，除了在种子中大量表达，在根、茎、叶、花等器官中也有表达，并且植物在受到干早、高盐、低温等胁迫以及植物激素脱落酸(ABA)诱导时，也会大量积累[2,7]。研究发现，在植物抵抗非生物胁迫过程中，LEA具有维持细胞膜稳定性、清除活性氧自由基、结合金属离子、保护细胞内酶等生物大分子的活性、防止蛋白聚集、稳定和保护蛋白质等功能[8-9]。

柠条锦鸡儿(Caraganakorshinskii)属于豆科锦鸡儿属植物，具有极强的生态抗逆性和广适性，对生态环境的维持起到重要的作用，同时柠条锦鸡儿的枝叶繁茂，营养丰富，适口性强，具有较高的饲用价值，是中国西北荒漠和半荒漠地区重要的栽培和饲用树种[10-11]，也是研究林木抗逆机制的理想材料之一。

本实验室前期从柠条锦鸡儿干旱胁迫下抑制性削减杂交文库(SSH)中筛选得到CkLEA4基因序列[12]，通过荧光定量PCR技术检测发现CkLEA4受脱水、盐胁迫和ABA处理的诱导[13]，推测其与柠条锦鸡儿逆境胁迫响应机制有关。本研究在此基础上构建了CkLEA4基因过表达载体并转化野生型拟南芥，分析了CkLEA4基因过表达转基因拟南芥在不同胁迫处理下的萌发状况，以期了解CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能，为进一步深入研究柠条锦鸡儿LEA基因的功能及利用其进行植物抗逆育种奠定基础。

1材料和方法

1.1植物材料

柠条锦鸡儿(CaraganakorshinskiiKom.)种子采自内蒙古赤峰市，野生型拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)Columbia-0生态型(Col-0)由本实验室保存。

1.2植物表达载体构建

设计特异引物CkLEA4-F1(5′-GCgtcgacATGCAGGGAGCAAAGAAAGC-3′，下划线为SalⅠ酶切位点)和CkLEA4-R1(5′-GCgagctcCTTAACTGTAAGTACCGCCAGTCC-3′，下划线为SacⅠ酶切位点)，以1月苗龄柠条锦鸡儿茎和叶片cDNA为模板扩增CkLEA4基因编码区。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生物公司)回收目的片段，插入克隆载体pEASY-Blunt-Simple(北京全式金生物公司)，测序验证后提质粒，经内切酶SalⅠ和SacⅠ(Thermo公司)酶切后，插入到由CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pCanG-HA中，酶切验证正确的重组质粒转化农杆菌GV3101，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。PCR引物合成及产物测序由上海生工生物公司完成。

1.3拟南芥遗传转化及纯合体筛选

采用浸花法将重组表达载体pCanG-CkLEA4转入野生型拟南芥，用25 mg/L卡那霉素筛选阳性植株。提取转基因植株总RNA，反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测转基因株系中的基因表达量。按照SYBRPremixExTaq试剂盒(Takara生物公司)说明书操作，利用LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(Roche公司)进行扩增。反应体系为:SYBRPremixExTaq10 μL，稀释的cDNA模板5 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)，灭菌水4.2 μL。PCR反应程序为:95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，40个循环。所用引物为CkLEA4-F2(5′-ACCCTGCTGAGGCATTTGGA-3′)和CkLEA4-R2(5′-CCTATTGGGACGAATAGAGGCAC-3′)，内参引物为AtEF1α-F(5′-AGAAGGGTGCCAAATGATGAG-3′)和AtEF1α-R(5′-GGAGGGAGAGAGA- AAGTCACAGA-3′)。基因表达量以2-ΔCT计算，选取3株表达水平较高的株系进行后续表型实验。

1.4不同胁迫处理萌发率分析

本实验室前期通过荧光定量PCR技术检测发现CkLEA4受脱水、盐胁迫和ABA处理的诱导[13]，推测其与柠条锦鸡儿逆境胁迫响应机制有关，在此基础上，检测了CkLEA4基因过表达转基因拟南芥种子在NaCl、甘露醇(mannitol)和ABA处理下的萌发状况。野生型和过表达拟南芥种子经75%乙醇灭菌10 min后，用含有0.05% Tween-20的100%乙醇灭菌10 min，待种子晾干后分别种在含有不同浓度NaCl(0、100、150和200 mmol/L)、ABA(0、1、2和3 μmol/L)和mannitol(0、200、300和400 mmol/L)的1/2 MS培养基上，每个株系各55颗种子，4℃同步化处理3 d，将平板取出置于22℃，16 h光照/8 h黑暗条件下培养。以胚根突破种皮为萌发标志，统计每天的种子萌发率，以子叶展开并呈现绿色为标志，统计子叶绿化率，检测拟南芥中过表达CkLEA4对胁迫处理下种子萌发和幼苗生长的影响。

2结果与分析

2.1pCanG-CkLEA4植物表达载体的构建

用特异引物CkLEA4-F1和CkLEA4-R1扩增获得长度为510 bpCkLEA4编码区(图1，A)，连接到克隆载体pEASY-Blunt-Simple中测序，测序验证后用SalⅠ和SacⅠ酶切并连接到线性化的表达载体pCanG-HA中。构建好的重组表达载体pCanG-CkLEA4用SalⅠ和SacⅠ双酶切鉴定，能够切出目的片段，说明表达载体构建成功(图1，B)。

2.2转基因纯合体植株鉴定

通过浸花法将重组植物表达载体pCanG-CkLEA4转入野生型拟南芥，卡那霉素筛选得到T3代阳性植株8株，通过荧光定量PCR对转基因植株进行纯合体鉴定，并检测了目的基因CkLEA4在转基因株系中的表达量(图2)，选取表达量较高的3个株系OE-12、OE-15和OE-19进行后续实验。

2.3转基因拟南芥盐胁迫耐受性检测

为检测野生型拟南芥和CkLEA4过表达株系在种子萌发阶段对盐胁迫的耐受性，将野生型和3个过表达株系OE-12、OE-15和OE-19，种在含有不同浓度NaCl的1/2 MS培养基中，4 ℃同步化处理3 d后，每天同一时间统计种子萌发率。结果(图3，A)显示，在1/2 MS培养基中，过表达株系和野生型的萌发率相近，没有明显区别；而在含有不同浓度NaCl的培养基中，3个过表达株系的萌发率均高于野生型；随着NaCl浓度增加，各株系萌发均受到抑制，但野生型萌发率下降幅度要高于过表达株系。以第4天时种子萌发率为标准，当NaCl浓度从100 mmol/L增加到200 mmol/L时，野生型萌发率下降了63.6%，而3个过表达株系平均萌发率只下降了26.1%。统计200 mmol/L NaCl处理下萌发第5天时子叶绿化率，3个过表达株系子叶绿化率显著高于野生型(图3，B)。以上结果说明CkLEA4过表达后提高了拟南芥种子萌发阶段对盐胁迫的耐受能力。

2.4转基因拟南芥渗透胁迫耐受性检测

A.CkLEA4；B.pCanG-CkLEA4；M.DL5000；

图2　过表达CkLEA4株系表达水平的实时荧光定量PCR检测

将野生型和过表达株系种在含有不同浓度mannitol的1/2 MS培养基中，统计种子萌发率。在0和200 mmol/L mannitol处理下，过表达株系和野生型萌发率相近；而当mannitol浓度增加至300和400 mmol/L时，过表达株系萌发率均明显高于野生型(图4，A)。随着mannitol浓度增加，各株系萌发率均下降，但野生型萌发率下降幅度要高于过表达株系。以第3天时种子萌发率为标准，当mannitol浓度从200 mmol/L增加到400 mmol/L时，野生型萌发率下降了66.1%，而3个过表达株系平均萌发率只下降了23.2%。并且400 mmol/L mannitol处理下萌发第5天时，过表达株系子叶绿化率也显著高于野生型(图4，B)。说明CkLEA4过表达后增强了拟南芥种子萌发阶段对渗透胁迫的耐受性。

A.不同浓度NaCl处理下野生型和过表达株系的萌发率统计；B.200 mmol/L NaCl处理下各株系子叶绿化率统计；**表示P < 0.01

2.5转基因拟南芥ABA敏感性检测

脱落酸(Abscisic acid，ABA)是一种重要的植物激素，参与种子休眠与萌发、植株生长、叶片脱落及气孔运动等多个植物生长发育过程，同时ABA在植物抵抗非生物胁迫过程中也发挥着重要的作用[14-15]。前期研究中发现，CkLEA4受ABA诱导[13]。为研究CkLEA4过表达后是否影响了拟南芥对ABA的敏感性，本研究检测了含有不同浓度ABA的1/2MS培养基上过表达株系的萌发情况。在不含ABA的1/2MS培养基中，过表达株系的萌发率与野生型相近；在1、2和3 μmol/L ABA处理下，过表达株系萌发率高于野生型(图5，A)。同时，低浓度ABA处理后各株系的子叶绿化率检测结果显示，在0.2和0.3 μmol/L ABA处理下，过表达株系的子叶绿化率均高于野生型(图5，B)。以上结果表明，CkLEA4过表达后降低了拟南芥对ABA的敏感性。

3讨论

干旱、盐碱、高温和寒冷等环境胁迫严重影响着植物的生长发育，从而极大地降低作物的产量。在长期的进化过程中，植物形成了一系列的代谢响应及防御机制来适应或应对这些非生物胁迫。LEA蛋白就是在逆境胁迫下诱导产生的具有保护细胞免受伤害、维持植物体基本生命活动的一类重要蛋白。

在实验室前期研究中，张燕娜等[13]根据Blast结果和系统进化分析将CkLEA4基因归为第4组LEA基因家族成员。大量研究表明，LEA4家族基因在植物抵抗非生物胁迫中起着重要的作用。Olvera-Carrillo等[16]发现过表达拟南芥AtLEA4-1、AtLEA4-2和AtLEA4-5能够增强植物对干旱胁迫的抵抗力；Liu等[17]将旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)的2个LEA4基因BhLEA1和BhLEA2在烟草中过表达后，提高了转基因烟草的抗旱性，减少了叶片失水率和电解质渗漏率，并且增加了SOD和POD的酶活性。大豆的2个LEA4蛋白GmPM1和GmPM9能够结合Fe3+、Ni2+、Cu2+和Zn2+等，减轻金属离子对植物的伤害[18]。Dalal等[19]分别利用35S和rd29S启动子将油菜(Brassicanapus)的LEA4-1基因插入到拟南芥基因组中，结果显示以这2种方式转入的拟南芥对盐和干旱胁迫均有很强的耐受性。

A.不同浓度mannitol处理下野生型和过表达株系的萌发率统计；B.400 mmol/L mannitol处理下子叶绿化率统计；*和**分别表示P<0.05和P<0.01

CkLEA4能够受到脱水、盐和ABA的诱导，因此推测其可能与植物抗逆功能相关。本研究发现，CkLEA4过表达拟南芥在NaCl、mannitol处理下的萌发率均高于野生型，说明CkLEA4增强了转基因拟南芥在萌发阶段对盐和渗透胁迫的耐受性。这一结论与过表达AtLEA3-3基因拟南芥在NaCl和mannitol处理下的种子萌发率结果一致[20]。玉米Rab28基因过表达后在15% PEG处理下的种子萌发率也高于野生型[21]。

A.不同浓度ABA处理下野生型和过表达株系的萌发率统计；B.0.2和0.3 μmol/L ABA处理下子叶绿化率统计

ABA在植物生长发育以及抵抗逆境胁迫过程中发挥着重要的作用，其主要功能之一是抑制种子萌发[14]。本研究中，在不同浓度的ABA处理下，CkLEA4过表达拟南芥萌发率均高于野生型，在0.2和0.3μmol/L ABA处理下，子叶绿化率也高于野生型，说明CkLEA4降低了拟南芥对ABA的敏感性，从而提高了萌发率。而与我们的实验结果相反，Zhao等[20]将拟南芥AtLEA3-3过表达后，在ABA处理下，过表达拟南芥与野生型相比萌发率无明显区别，但子叶绿化率明显高于野生型。我们推测可能的原因是，LEA蛋白基因是一类大的基因家族，拟南芥中有51个成员[7]，大豆中至少有36个[22]，不同的家族成员在植物抵抗非生物胁迫中可能具不同的功能，CkLEA4属于第4组LEA基因，AtLEA3-3属于第3组LEA基因，且CkLEA4与AtLEA3-3氨基酸序列相似度仅为16.2%，二者在ABA处理下种子萌发过程中可能起着不同的作用，其具体的作用机制还有待于进一步研究。

参考文献:

[1]DURE,L III,GREENWAY S C,GALAU G A.Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination:changing messenger ribonucleic acid populations as shown byinvitroand in vivo protein synthesis[J].Biochemistry,1981,20(14):4 162-4 168.

[2]SHIH M D,HOEKSTRA F A,HSING Y IC.Late embryogenesis abundant proteins[J].AdvancesinBotanicalResearch,2008,48:211-255.

[3]KIKAWADA T,NAKAHARA Y,KANAMORI Y,etal. Dehydration-induced expression of LEA proteins in an anhydrobiotic chironomid[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2006,348(1):56-61.

[4]BROWNE J,TUNNACLIFFE A,BURNELL A.Anhydrobiosis:plant desiccation gene found in a nematode[J].Nature,2002,416(6 876):38.

[5]BATTISTA J R,PARK M J,MCLEMORE A E.Inactivation of two homologues of proteins presumed to be involved in the desiccation tolerance of plants sensitizes Deinococcus radiodurans R1 to desiccation[J].Cryobiology,2001,43(2):133-139.

[6]STACY R A,AALEN R B.Identification of sequence homology between the internal hydrophilic repeated motifs of group 1 late-embryogenesis-abundant proteins in plants and hydrophilic repeats of the general stress protein GsiB ofBacillussubtilis[J].Planta,1998,206(3):476-478.

[7]HUNDERTMARK M,HINCHA D K.LEA (Late Embryogenesis Abundant) proteins and their encoding genes inArabidopsisthaliana[J].BMCGenomics,2008,9:1-22.

[8]SUN X L,RIKKERINK EHA,JONES W T,etal. Multifarious roles of intrinsic disorder in proteins illustrate its broad impact on plant biology[J].PlantCell,2013,25(1):38-55.

[9]CHAKRABORTEE S,TRIPATHI R,WATSON M,etal. Intrinsically disordered proteins as molecular shields[J].MolecularBiosystems,2012,8(1):210-219.

[10]XU D H,FANG X W,SU P X,etal. Ecophysiological responses ofCaraganakorshinskiiKom.under extreme drought stress:leaf abscission and stem survives[J].Photosynthetica,2012,50(4):541-548.

[11]XIAO S C,XIAO H L,PENG X M,etal. Dendroecological assessment of Korshinsk peashrub (CaraganakorshinskiiKom.) from the perspective of interactions among growth,climate,and topography in the western Loess Plateau,China[J].Dendrochronologia,2015,33:61-68.

[12]杨杞,张涛,王颖,等.干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库构建及CkWRKY1基因克隆[J]. 林业科学,2013,49(7):62-68.

YANG Q,ZHANG T,WANG Y,etal. Construction of a suppression subtractive hybridization library ofCaraganakorshinskiiunder drought stress and cloning ofCkWRKY1 gene[J].ScientiaSilvaeSinicae,2013,49(7):62-68.

[13]张燕娜,于秀敏,杨杞，等. 柠条锦鸡儿CkLEA4基因克隆及表达分析[J]. 西北植物学报,2014,34(1):47-53.

ZHANG Y N,YU X M,YANG Q,etal.Clone and expression analysis ofCkLEA4 fromCaraganakorshinskiiKom.[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2014,34(1):47-53.

[14]FINKELSTEIN R R,GAMPALA S SL,ROCK C D.Abscisic acid signaling in seeds and seedlings[J].PlantCell,2002,14:S15-S45.

[15]LEUNG J,GIRAUDAT J.Abscisic acid signal transduction[J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,1998,49:199-222.

[16]OLVERA-CARRILLO,Y,CAMPOS,F,REYES,J L,etal. Functional analysis of the group 4 late embryogenesis abundant proteins reveals their relevance in the adaptive response during water deficit inArabidopsis[J].PlantPhysiology,2010,154(1):373-390.

[17]LIU X,WANG Z,WANG L L,etal. LEA 4 group genes from the resurrection plantBoeahygrometricaconfer dehydration tolerance in transgenic tobacco[J].PlantScience,2009,176(1):90-98.

[18]LIU G,XU H,ZHANG L,etal. Fe binding properties of two soybean (GlycinemaxL.) LEA4 proteins associated with antioxidant activity[J].PlantandCellPhysiology,2011,52(6):994-1 002.

[19]DALAL M,TAYAL D,CHINNUSAMY V,etal. Abiotic stress and ABA-inducible Group 4 LEA fromBrassicanapusplays a key role in salt and drought tolerance[J].JournalofBiotechnology,2009,139(2):137-145.

[20]ZHAO P S,LIU F,MA M,etal. Overexpression ofAtLEA3-3 confers resistance to cold stress inEscherichiacoliand provides enhanced osmotic stress tolerance and ABA sensitivity inArabidopsisthaliana[J].MolecularBiology,2011,45(5):785-796.

[21]AMARA I,CAPELLADES M,LUDEVID M D,etal. Enhanced water stress tolerance of transgenic maize plants over-expressing LEARab28 gene[J].JournalofPlantPhysiology,2013,170(9):864-873.

[22]李乐,许红亮,杨兴露,等．大豆LEA基因家族全基因组鉴定、分类和表达[J]．中国农业科学,2011,44(19):3 945-3 954．LI L,XU H L,YANG X L,etal.Genome-wide identification,classification and expression analysis of LEA gene family in soybean[J].ScientiaAgriculturaSinica,2011,44(19):3 945-3 954．

(编辑:宋亚珍)

Stress Tolerance of TransgenicArabidopsisExpressingCkLEA4 Gene during Seed Germination Stage

YU Xiumin,ZHANG Yanna,YUE Wenran,YANG Qi,WAN Yongqing,LI Guojing,WANG Ruigang*

(College of Life Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018，China)

Abstract:Based on our previous study,CkLEA4,a Caragana korshinskii LEA gene induced by dehydration,salt and ABA treatments,was transferred into Arabidopsis. The transgene expression of eight T3 transgenic plants was detected by quantitative real-time PCR and three independent overexpression lines with different transgene expression level were selected for further analysis.For the germination assays,CkLEA4 overexpression lines germinated more quickly than that of wild-type on medium containing different concentrations of NaCl,mannitol or ABA.The germination rate of wild-type and CkLEA4 overexpression lines were all decreased with the increased concentrations of NaCl,mannitol or ABA,while the germination rate of wild-type decreased more dramatically than that of the overexpression lines.The cotyledon greening rates of CkLEA4 overexpression lines were also higher than those of wild-type under 200 mmol/L NaCl,400 mmol/L mannitol or low concentrations of ABA.Altogether,our results suggested that CkLEA4 improved Arabidopsis tolerance to salt,ABA and osmotic stress during seed germination stage.

Key words:Caragana korshinskii;late embryogenesis abundant (LEA) proteins;abiotic stress;transgenic Arabidopsis

文章编号:1000-4025(2016)04-0648-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0648

收稿日期：2016-01-05；修改稿收到日期：2016-03-09

基金项目：国家自然科学基金(31560199)；内蒙古自治区产业创新创业人才团队(2015-2016)；内蒙古自治区草原英才工程(2014-2016)

作者简介：于秀敏(1989-)，女，在读博士研究生，主要从事植物生物化学与分子生物学研究。E-mail:yuxiumin565@126.com *通信作者：王瑞刚，博士，教授，博士生导师，主要从事植物生物化学与分子生物学研究。E-mail:wangruigang@ imau.edu.cn

中图分类号：Q785;Q786

文献标志码：A