拟南芥bso-1突变体的基因定位及表型分析

夏群芳，周树敏，王伟倩，李瑞沙，张红莉，张　卫

(上海大学 生命科学学院，上海市能源作物重点实验室，上海 200444)

拟南芥bso-1突变体的基因定位及表型分析

夏群芳，周树敏，王伟倩，李瑞沙，张红莉，张卫*

(上海大学 生命科学学院，上海市能源作物重点实验室，上海 200444)

摘要:通过EMS化学诱变在拟南芥Columbia(Col-0)野生型突变体库中筛选获得1株器官显著增大的突变体，命名为big size organ1(bso-1)。遗传分析表明，bso-1受单个隐性核基因控制。表型观察发现，突变体植株的幼苗、花、果荚及种子与野生型相比都表现出明显的增大。组织切片结果显示，突变体种子的增大主要由胚细胞个体增大导致胚体积增大而实现，因此突变体种子的重量也较野生型有明显增加。利用图位克隆方法将相关基因初步定位在4号染色体上SSLP标记T5L19与F28M11之间58kb区间内，生物信息学分析显示此区间内未见调控植物器官大小发育相关的已知基因的报道。该研究结果为进一步克隆bso-1突变体相关基因及探讨其在控制植物器官发育尤其是种子发育过程中的作用奠定了基础。

关键词:拟南芥；种子；器官；基因定位

器官大小是植物的一个重要形态特征，它具有严格的种属特异性，在同等条件下同种生态型植株器官大小差异基本可以忽略。器官大小受外界因素如光照、营养等的影响较小，主要由其内在生物学机制进行调控。器官发育需要经历细胞分裂、细胞分化及细胞生长等一系列复杂的生物学过程，其中细胞分裂和细胞扩张是影响器官最终大小的重要因素。拟南芥(Arabidopsisthaliana)器官大小相关调控基因可通过不同途径调控细胞分裂及生长：转录调控途径，如JAGGED编码一个锌指蛋白，通过延迟或激活细胞周期，影响细胞分裂，从而改变器官大小[1]；激素(生长素、赤霉素、油菜素内酯、细胞分裂素等)调节途径；细胞壁松弛等途径[2]。

种子不仅在植物环境适应方面起重要作用，在农业生产中也有重要的利用价值。研究种子大小相关的调控基因对于改良作物品质，提高作物产量具有重要理论意义和应用价值。被子植物的种子一般由胚、胚乳和种皮组成，一般情况下基因通过影响这三部分的细胞分裂和生长来调控种子的发育。例如：拟南芥中CYP78A5和ARF2过促进或抑制种皮细胞分裂从而影响种子的发育进程和最终的体积[3-6]；TTG2和AP2则通过调控种皮细胞的伸长来改变种子大小[7-8]；EOD3/CYP78A6可同时影响细胞分裂和细胞伸长来调控种皮表面积大小，进而影响种子的大小[9]；SHB1通过增强胚乳细胞分裂，促进种子生长[10]。然而，迄今为止对于植物中调控和决定器官大小的相关分子机制的了解还十分有限。

本实验通过对EMS化学诱变的拟南芥突变体库进行筛选，获得了1株器官体积显著增大的突变体，根据其表型，暂命名为bso-1(bigsizeorgan1)。本研究主要对bso-1突变体进行了相关基因的定位和表型观察，以期为后续BSO-1基因克隆及功能分析积累实验数据。

1材料和方法

1.1植物材料种植

拟南芥Columbia(Col)生态型和bso-1突变体种子点种到培养介质(黑土∶蛭石=1∶3)中，覆盖1层保鲜膜，4 ℃春化3～4 d后，移至光照培养间培养，培养条件为：温度23 ℃，湿度：60%～70%，光照强度：50 μE·m-2·s-1,16 h光照/8 h黑暗，待种子萌发长出2片真叶时揭去薄膜[11]。

1.2植株形态学观察及表型统计

选取Col与bso-1同一时期的莲座叶，在Leica DM750生物显微镜下(6×8倍放大)观察叶刺形状变化并统计叶片表面表皮毛数量。

1.3花粉母细胞核型分析

收集5～6期花药，在载玻片上轻轻挤压出花粉母细胞，利用DAPI染液对花粉母细胞进行染色，封片后在Leica DM2500荧光显微镜下观察并拍照。

1.4bso-1突变体遗传分析

以bso-1突变体为母本，Col野生型为父本，回交得到F1代植株，观察表型；F1代植物自交得到的F2代植株，用于表型观察和统计分析。

1.5石蜡切片

将成熟种子浸泡在50% FAA中常温过夜；取出种子，置于50%酒精30 min，洗去固定液；50%～100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。用旋转式切片机做连续切片，切片厚度5 μm。切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，1%甲苯胺蓝染色，中性树胶封片。在Leica DM2500光学显微镜下观察并拍照[12]。

1.6基因图位克隆

突变体与Ler野生型杂交所得的F1代植株通过自交获取F2代植物。选取F2代植物中具有突变体表型的植株用于基因定位分析。基因图位克隆步骤参照张卫等的方法[13]。所需分子标记参考网站(http://amp.genomics.org.cn)上的相关信息。

2结果与分析

2.1bso-1 形态观察及分析

通过对bso-1突变体和野生型拟南芥植物的形态学比较发现：突变体bso-1的幼苗较野生型植株有所增大(图1，A、B)，而且花萼、花瓣相比野生型有显著的增大(图1，D、H)，果荚在长度和宽度上都超过了野生型(图1，E)。此外，突变体植株叶形比野生型显得更圆，叶柄也更明显(图1，F、G)，而且对比相同生长发育时期的植株形态，突变体植株也较野生型显著增高(图1，C)，同时表现出明显的晚花特征(图1，I、J)。以上结果说明，与野生型植株相比，突变体bso-1植株在多种器官上都存在不同程度的增大效应。

2.2bso-1突变体体细胞染色体数目鉴定

器官体积增大是多倍体植株最为显著的特征，主要表现在叶片、花、果实及种子等的形态特征上[14]。为了鉴别bso-1突变体器官增大的表型是否为多倍体的特征表现，我们通过DAPI染色，对突变体花粉母细胞染色体数目进行检测，发现其中的染色体数目正常，为5对(图2箭头所示)，这表明bso-1突变体器官增大的表型变化并不是由染色体多倍体化所导致的。

A、F.野生型幼苗；B、G.突变体幼苗；C.野生型与突变体植株大小比较(均为抽苔后开出第15朵花时的植株)；D.野生型与突变体花器官的比较；E.野生型与突变体果荚的比较；H.野生型与突变体萼片的比较； I.野生型和突变体植株开花时间的统计比较(n≥15, P<0.05)；J.野生型与突变体开花早晚的比较(同为12～14片莲座叶时的植株照片)图1　拟南芥突变体bso-1表型观察A,F. Seedling of wild type； B,G. Seedling of bso-1; bso-1 plant(C), flower organ(D), silique(E) and sepal(H), and flower time(I and J) compared with wild type (n≥15, P<0.05)Fig.1　Phenotype analyses of bso-1

通过DAPI染色法对花粉母细胞中染色体数目进行观察，箭头所示部位为染色体图2　突变体bso-1染色体检测DAPI assay of chromosome numbers in microsporocyte. Arrows indicate chromosomesFig.2　The chromosome number detection of bso-1

2.3bso-1突变体表皮毛的观察及分析

拟南芥的表皮毛是一种特化的、典型的单细胞表皮毛，没有腺体，一般有3个分支[15]。将叶片置于光学显微镜下观察发现bso-1突变体单位面积表皮毛数量较野生型植株有一定程度的增多(图3，A、E)，野生型植株叶片表皮毛多为3个分支(图3，B、F)，而bso-1突变体表皮毛分支数量增加至4个以上(图3，C、D和F)。这些结果预示着bso-1突变体的相关突变基因与植株表皮毛生长发育也具有一定的相关性。

2.4bso-1遗传分析

以bso-1突变体为母本，Col野生型为父本进行回交得到F1代种子，F1代植株均为野生型表型，说明该突变体受隐性基因调控。F1代植株通过自交所得的F2代植物中出现表型性状的分离，即突变体表型(102株)与野生型表型(313株)比例约为1∶3，符合孟德尔遗传定理。因此，可以初步确定突变体表型受单个隐性核基因控制。

2.5bso-1突变体种子的观察与分析

bso-1突变体与野生型相比较最明显也是最有价值的表征是其种子的大小比野生型植物(不论是Col型还是Ler型)有明显的增长(图4，A)。对种子重量的统计发现，bso-1突变体种子重量几乎是野生型的1倍(图4，B)。剥出种子的胚进行比较，发现bso-1种子胚的体积远大于野生型种子的胚(图4，C、D)。通过石蜡切片对比观察野生型与bso-1突变体的胚细胞的数量和大小，结果显示两者种子胚细胞的大小相当，但是突变体种子胚中细胞的数量显著增多(图4，E、F)，同时对种皮细胞的大小作比较显示细胞的大小并无显著差异(图4，G、H)。以上结果预示bso-1种子变大跟其内部胚体积增大相关，且bso-1突变体相关基因可能通过调控细胞分裂增长来影响种子胚的大小，从而决定种子体积。

A.野生型与突变体叶片表皮毛密度的比较；B. 野生型表皮毛典型的3个分叉；C. 突变体4个分叉的表皮毛； D. 突变体中5个分叉的表皮毛；E.叶片单位面积上表皮毛数量的统计结果；F. 野生型和突变体中不同分叉形式的表皮毛的比率。统计数据来源于3组独立实验，每个数据至少取样10个植株，每株取第3、4、5片真叶进行统计(P<0.05)图3　野生型与bso-1突变体叶片表皮毛数量及形态的分析A. The density of trichomes in bso-1 compared with wild type; B. The typical trichome in wild type; C. Four branchy trichome in bso-1; D. Five branchy trichome in bso-1; E. Trichome number statistics in per unit area; F. The ratio of different trichome numbers in bso-1 and wild type. The statistical data come from three independent experiments, at least 10 plants had been used for per data. The materials come from and the third, fourth and fifth true leaf(P<0.05).Fig.3　The chromosome number detection of bso-1

A.野生型与突变体种子大小的比较；B.野生型与突变体种子重量的比较(100粒种子的平均重量，每组数值重复5次)；C、D. 野生型与突变体种子胚大小的比较；E、F. 野生型与突变体种子的石蜡切片；G、H.野生型与突变体种皮细胞的比较图4　野生型与突变体种子的比较Comparison of bso-1 and wild type seed size (A) and average seed weight (B) (milligrams per 100 seeds, Standard deviations are shown, n=5);Embryo size in wild type (C) and bso-1(D); Paraffin sections of seed showing embryo and seed coat in wild type (E, G) and bso-1(F, H).Fig.4　Comparison of bso-1 and wild type seeds

2.6bso-1突变体相关基因的定位

遗传分析显示bso-1突变体由一个隐性基因控制，因此通过图位克隆方法对bso-1的突变基因进行了定位。利用网站(http://amp.genomics.org.cn)上发布的信息，选择在拟南芥Col生态型和Ler生态型之间存在多态性的区段为分子标记设计引物。首先选用在拟南芥基因组中均匀分布的20个分子标记(表1)进行粗定位，结果显示，突变位点与4号染色体上的SSLP分子标记F28A11连锁(图5，A)。进一步在4号染色体上设计新的分子标记(表1)对突变基因进行精细定位，部分定位结果如图5，B所示，利用分子标记F1K3和FCA2在23个样本中均只鉴定出2个重组子，且2个分子标记鉴定出的重组子并不在同一样本中(F1K3鉴定结果显示4、13号样本为重组子，而FCA2鉴定结果显示8、17号样本为重组子)，这说明这2个分子标记位于突变位点两侧。进一步在上述两分子标记之间的区域内选择分子标记进行定位。最终将bso-1的突变位点定位在4号染色体上T5L19与F28M11之间58kb区间内(图5，A)。通过生物信息学数据的分析(http://www.arabidopsis.org)显示此区间内含有约50个候选基因，但未见有与植物器官发育调控相关基因的报道。

表1　分子标记引物表

A.bso-1突变基因在4号染色体上的定位区域示意图；B. 部分基因定位结果(以F1K3和FCA2分子标记为例)：L.Ler； C.Col ； 1～23 表示1～23号样本；*表示出现重组子的样本。图5　bso-1突变体基因定位示意图A. Gene mapping of bos-1 on 4 chromosome; B. The part results of PCR analysis for mapping：L indicates Ler, C indicates Col，Line 1-23 indicate 23 different samples； * means the recombinant in a sample.Fig. 5　Genetic mapping of bso-1

3讨论

植物种子和器官大小是重要的生物性状，也是植物健康生长的重要指标，器官大小的调控一直以来都是发育生物学领域的研究热点之一。已知许多母系遗传因子如TTG2、AP2、ARF2、CYP78A5/KLUH、CYP78A6/EOD3、DA1和DA2等都能影响植物器官和种子的大小[3,4,7-9,16]。最新研究证明拟南芥中泛素受体DA1通过直接与去泛素化酶SOD2互作，介导SOD2的降解，从而调控拟南芥种子和器官的发育，最终影响其体积大小[16]。然而，对于植物中决定其种子及器官大小的详细分子机理还需不断地深入研究。本实验室获得的突变体bso-1，通过可见表型观察发现其不但具有较大的花、果荚、种子，而且植株也较野生型更高大，并表现出明显的晚花特征。虽然，植物中器官体积增大是多倍体植株的典型特征之一，但通过DAPI染色鉴定显示bso-1染色体数目正常，这意味着bso-1突变体中器官体积的增大并不是多倍体效应所致。因此作为单基因隐性突变体的bso-1，其器官增大特性的广泛表现也意味着此基因对于植物生长发育调控起着至关重要的作用，对此基因的克隆显得十分必要。

拟南芥表皮毛的形成主要分为以下过程：表皮毛发生及排布、核内复制、分支形成、分支生长方向的确定。相比野生型植株，bso-1突变体表皮毛分支的生长方向发生变化，分支增加至4个以上。已有研究发现在表皮毛形态建成中微丝微管具有重要作用，其中微丝参与表皮毛突起形成的发生和排布，微管则与突起延长有关。因此bso-1突变体基因是否参与调控微管的形成，从而改变表皮毛突起延长的方向，最终影响表皮毛分支生长方向，导致分支增加[17]，这也将是后续对bso-1基因功能研究有待解答的问题。将Col与bso-1种子的胚进行比较，发现bso-1种子的胚明显增大。石蜡切片观察显示突变体种子增大主要是胚细胞增多导致，这也预示着bso-1突变体相关基因与细胞分裂可能存在密切联系。此外，种子的生长需要胚、胚乳及种皮共同协调作用，突变体种子变大，除胚明显变大外，也有赖于种皮的生长，以避免种皮对胚生长的抑制，所以我们推测bso-1突变体相关基因还能够控制珠被细胞分裂或伸长来影响种皮生长，最终影响种子大小。

通过图位克隆bso-1突变体相关基因被大致定位在4号染色体上SSLP标记T5L19与F28M11之间58kb区间内，生物信息学分析显示此区间内未见调控植物器官大小发育相关已知基因的报道。因此，后续还需进一步实现基因的克隆和功能分析，以阐述bso-1突变体相关基因是通过何种途径调控种子和器官最终大小的分子机理。

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(编辑:宋亚珍)

Gene Mapping and Phenotype Analyses of anArabidopsisMutantbigsizeorgan1

XIA Qunfang, ZHOU Shumin, WANG Weiqian, LI Ruisha, ZHANG Hongli, ZHANG Wei*

(School of Life Science, Shanghai Key Laboratory of Bio-energy Crops, Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Abstract:An abnormal organs mutant big size organ-1 (bso-1), was isolated by enthyl-methane sulfonate (EMS) mutagenesis strategy. Genetic analysis indicated that the mutation phenotype was controlled by one recessive nuclear gene. Compared to the wild-type, bso-1 showed significant increase in seedling, flowers, pods and seeds. The detection in paraffin sections of seeds displayed that the increase of the bso-1 seeds primarily due to the increase of germ cell, so the seeds of bso-1 is heavier than that of wild type. The mutation loci was mapped to the region of 58kb between SSLP marker T5L19 and F28M11 on Chr.4. According to the result of bio-informatics analysis, there are no previous genes about organ development in the region. The results provide a basis for further cloning and functional analysis of bso-1 in organ development, especially in seed development.

Key words:Arabidopsis; seed; organ; gene mapping

文章编号:1000-4025(2016)04-0641-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.04.0641

收稿日期:2015-12-14;修改稿收到日期:2016-03-18

基金项目:上海市自然科学基金(15ZR1416700)；国家自然科学基金(30870225)；上海市浦江计划项目(08PJ1405500)

作者简介:夏群芳(1990-)， 女，在读硕士研究生， 主要从事拟南芥温敏雄性不育的研究。E-mail:roubaoxia@163.com *通信作者:张卫，博士，教授，主要从事拟南芥育性研究。E-mail:zhw62207@shu.edu.cn

中图分类号:Q944.2;Q343.1+7

文献标志码:A