正丁酸钠对涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2侵袭、迁移的影响及机制研究*

王　越，吴娟娟，刘　昕，李亦婕，王　雨，魏　丹，宋　琦，李　萍△

(1.遵义医学院口腔组织病理学教研室，贵州遵义 563000；2.贵州省贵阳市口腔医院预防科　550000)



正丁酸钠对涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2侵袭、迁移的影响及机制研究*

王越1，吴娟娟2，刘昕1，李亦婕1，王雨1，魏丹1，宋琦1，李萍1△

(1.遵义医学院口腔组织病理学教研室，贵州遵义 563000；2.贵州省贵阳市口腔医院预防科550000)

[摘要]目的探讨不同浓度正丁酸钠对涎腺腺样囊性癌细胞株ACC-2侵袭、迁移的影响与其作用机制。方法噻唑蓝(MTT)法探索正丁酸钠作用ACC-2细胞的最佳浓度，Transwell小室实验检测正丁酸钠对ACC-2细胞侵袭、迁移能力的影响，Western blot和实时荧光定量PCR(RT-PCR)分别检测5组浓度药物作用后ACC-2细胞中高迁移率族蛋白1(HMGB1)、TLR4的mRNA和蛋白的表达。结果与对照组相比，0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mmol/L 5组浓度的正丁酸钠均能抑制ACC-2细胞增殖(P<0.05)且呈明显浓度依赖性；5组浓度正丁酸钠对细胞侵袭能力的影响差异无统计学意义(P>0.05)；2.500、5.000、10.000 mmol/L浓度正丁酸钠可以抑制ACC-2细胞的迁移能力(P<0.05)，同时降低ACC-2细胞HMGB1、TLR4的mRNA及蛋白表达(P<0.05)；相关性分析显示TLR4蛋白表达的降低与HMGB1的抑制呈正相关(r=0.810，P<0.05)。结论正丁酸钠能够抑制ACC-2细胞增殖，浓度较高时可以抑制ACC-2细胞的迁移能力，同时降低HMGB1、TLR4的mRNA与蛋白表达，提示NaB对ACC-2迁移能力抑制可能通过下调HMGB1、TLR4的mRNA及蛋白表达来实现。

[关键词]涎腺肿瘤；癌,腺样囊性；正丁酸钠；高迁移率蛋白-1；toll样受体-4；侵袭；迁移

涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是唾液腺高发的恶性肿瘤，它具有局部侵袭性强、易沿神经鞘及组织间隙扩散、易发生远处转移等特点。正丁酸钠(sodium butyrate，NaB)是存在于结肠内的天然副产品，具有调节哺乳动物细胞内的基因、阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、促进凋亡、参与细胞分化的作用，因此被认为是具有潜力的化疗药物[1]。本实验主要探索正丁酸钠对涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株侵袭、迁移能力的影响，并初步探讨其作用机制，为筛选临床靶向药物，治疗涎腺腺样囊性癌提供初步的理论依据。

1材料与方法

1.1材料ACC-2细胞株(中国典型培养物保藏中心)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物科技有限公司)，NaB(sigma，美国)，噻唑蓝(MTT，中国索莱宝公司)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，Millipore，美国)，高迁移率族蛋白1(HMGB1)多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，TLR4多克隆抗体(Bioworld，美国)，800CW荧光二抗(中国基因有限公司)，蛋白电泳系统、电转移系统(BIO-RAD，美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养ACC-2细胞常规复苏，MEM完全培养液(含1%双抗、1%谷氨酰胺、10%FBS)、37 ℃、5%CO2、100%湿度，传代培养。

1.2.2MTT法对实验组药物浓度的筛选对数期细胞接种于96孔板，每孔细胞密度5×103，100 μL/孔、37 ℃、5%CO2培养。NaB浓度0～≤20 mmol/L，每次实验选择5个药物浓度(对照组0 mmol/L)，100 μL/孔、37 ℃、5%CO2，培养20 h。避光加入0.5%MTT液20 μL，培养4 h，每孔加150 μL DMSO，酶标仪于490 nm检测各孔的光密度(OD)值。按以下公式计算：细胞存活率=(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)×100%，并绘制剂量-效应曲线。每组实验重复3次。

1.2.3Transwell小室的侵袭和迁移实验按说明书配胶、铺胶，1×105个/孔细胞悬液接种于上室，对照组加100 μL不含药物的基础培养基，实验组分别加入0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mmol/L浓度NaB 100 μL。下室加含20% FBS的培养基、37 ℃、5%CO2，培养24 h。取出小室，淋洗、晾干、固定、染色、切下Transwell膜、中性树胶封片。随机选出10个视野在显微镜下观察、拍照、计数，每组实验重复3次。细胞迁移实验中除了Transwell小室不铺胶，细胞悬液为1×104个/孔外，其余方法同侵袭实验。

1.2.4Western blot对HMGB1、TLR4蛋白表达的测定取对数期细胞待贴壁后分为对照组和实验组，对照组不做干预，实验组细胞用0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mmol/L浓度NaB处理、37 ℃、5%CO2，培养24 h、提取蛋白、电泳，HMGB1蛋白使用12%分离胶，TLR4使用8%分离胶，转膜，5%脱脂奶粉，封闭1 h，分别用HMGB1多克隆抗体(1∶500)、TLR4多克隆抗体(1∶500)与800 CW荧光二抗(1∶10 000)孵育2 h。ODYSSEY扫描蛋白条带，读取灰度值，收集蛋白印记图。每组实验重复3次。

1.2.5实时荧光定量PCR(RT-PCR)对HMGB1、TLR4 mRNA含量测定30 μL DEPC水溶解提取的RNA沉淀。光谱图和D260/D280来判定RNA的提取质量，将每组的RNA浓度用DEPC水稀释为200 ng/μL，反转录合成cDNA。PCR检测HMGB1及TLR4的表达,反应条件为:95 ℃预变形3 min、1循环，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s、40循环，55 ℃延伸 10 s、81循环。引物由日本TaKaRa生物工程公司合成。引物如下，HMGB1上游引物：5′-AGG ATC CCA ATG CAC CCA AG-3′，下游引物：5′-CGC AAC ATC ACC AAT GGA CA-3′；TLR4上游引物：5′-TGA GCA GTC GTG CTG GTA TC-3′，下游引物：5′-CAG GGC TTT TCT GAG TCG TC-3′；β-action为内对照，上游引物：上游5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′，下游引物：5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，于GelDoc XR凝胶成像系统上观察。

2结果

2.1MTT法对实验组药物浓度的筛选MTT结果显示，选取NaB浓度0～≤20 mmol/L 15个浓度作用ACC-2 24 h后，与对照组相比，浓度为0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mmol/L时，NaB对ACC-2细胞增殖有抑制作用(P<0.05)；且随着药物浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，其作用呈明显浓度依赖性；浓度为0.150、0.300、0.600 mmol/L时NaB对细胞增殖无抑制作用(P>0.05)，当药物在1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 mmol/L浓度时，虽均对细胞增殖有抑制作用，但在16.000 mmol/L左右时到达了平台浓度，且线性关系不够突出，见图1。

2.2Transwell小室实验对细胞迁移和侵袭能力的测定与对照组相比，NaB浓度仅在2.5、5.0、10.0 mmol/L时可以抑制ACC-2细胞的迁移能力(P<0.05)；与对照组相比，5个浓度组的NaB作用后ACC-2细胞的侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

2.3RT-PCR实验对HMGB1、TLR4 mRNA含量的测定

2.3.1HMGB1与TLR4 mRNA的相对表达量RT-PCR结果显示，与对照组相比，药物浓度在2.5、5.0、10.0 mmol/L浓度药物可以使HMGB1、TLR4的相对表达量降低(P<0.05)，其余浓度组药物的作用均差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　RT-PCR检测各组HMGB1 mRNA与

a:P<0.05，与对照组比较。

2.3.2HMGB1、TLR4、β-actin扩增产物的鉴定根据引物说明书，HMGB1、TLR4、β-actin的扩增产物分别为110、167、186 bp片段，经琼脂糖凝胶电泳后在相应的区域出现条带，且条带灰度较为均一，说明扩增产物无误，且为单一产物，见图3。

*：P<0.05，与对照组比较；A:NaB 0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mmol/L组比较；B:NaB 0.150、0.300、0.600、1.200、2.400 mmol/L浓度组比较；C:NaB 1.000、2.000、4.000、8.000、16.000 mmol/L浓度组比较。

图1不同浓度NaB对ACC-2细胞增殖的影响

A～E：不同浓度的正丁酸钠对ACC-2细胞迁移的影响；a～e:不同浓度的正丁酸钠对ACC-2细胞侵袭的影响。A/a：对照组；B/b：0.625 mmol/L组；C/c：1.250 mmol/L组；D/d：2.500 mmol/L组；E/e：5.000 mmol/L组；F/f：10.000 mmol/L组。

图2不同浓度的NaB对ACC-2细胞迁移与侵袭的影响(HE ×100)

1：对照组；2：0.625 mmol/L组；3：1.250 mmol/L组；4：2.500 mmol/L组；5：5.000 mmol/L组；6：10.000 mmol/L组。

图3HMGB1、TLR4、β-actin扩增产物琼脂糖凝胶电泳

M:Marker；1:10.000 mmol/L NaB；2：5.000 mmol/L NaB；3：2.500 mmol/L NaB；4：1.250 mmol/L NaB；5：0.625 mmol/L NaB；6：0 mmol/L NaB。

图4Western-blot检测ACC-2细胞TLR4、HMGB1、β-actin蛋白表达

2.4Western-blot实验对HMGB1、TLR4蛋白表达的测定实验结果：ACC-2细胞实验组与对照组均有HMGB1和TLR4蛋白的表达，见图4。与对照组相比，NaB浓度为2.5、5.0、10.0 mmol/L可使ACC-2细胞中HMGB1、TLR4蛋白的表达降低(P<0.05)，见图5。相关分析显示ACC-2细胞各组的HMGB1与TLR4蛋白表达呈正相关，Pearson相关系数r=0.810,P<0.05,见图6。

A：ACC-2细胞HMGB1蛋白表达；B:ACC-2细胞TLR4蛋白表达。*:P<0.05，与对照组比较。

图5Western-blot检测ACC-2各组细胞中HMGB1蛋白与TLR4蛋白的相对表达量

图6　HMGB1与TLR4蛋白的相关分析

3讨论

NaB是食物纤维在肠道中经细菌酵解的一种只含4个碳原子的简单有机酸盐，是一种有效的组蛋白抑制剂，有报道指出NaB能减少c-myc基因的mRNA水平，从而抑制细胞分裂增殖，促进凋亡，参与细胞分化，直接或间接地影响细胞周期的自发转换率[2-3]。在恶性黑色素瘤的研究中发现，NaB可将细胞周期阻滞在G1/G0期和S期，抑制细胞的增殖[4]。通过查阅相关文献，将NaB对细胞株作用的浓度锁定在0～20 mmol/L。本实验采用MTT法，选取了该范围内3组浓度梯度的NaB用于探索其有效抑制浓度，并发现0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mmol/L浓度的NaB作用24 h后，可以有效抑制ACC-2细胞增殖，且随着药物浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，其作用呈浓度依赖性。因此将这5个浓度作为随后实验浓度。

肿瘤的转移是一个复杂的生物学过程，涉及癌细胞从原发灶脱落，分泌细胞因子，如基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)破坏穿透基底膜降解细胞外基质及向远处转移[5]。Transwell小室常用于体外检测细胞迁移和侵袭能力。有实验证实MMP-2与MMP-9在ACC中的阳性表达率均明显高于正常唾液腺组织，但远远低于腺样囊性癌细胞高转移株ACC-M细胞[6]。本实验中各浓度组的NaB对ACC-2细胞的侵袭能力均无明显影响(P>0.05)，且只有较高浓度的NaB(浓度在2.5、5.0、10.0 mmol/L)作用于ACC-2时，才能抑制细胞的迁移能力。这可能是因为ACC-2细胞自身侵袭能力较弱，破坏细胞外基质的能力有限，外界药物对其影响有限。提示NaB对于恶性表型相对较低的ACC-2细胞作用并不突出。

NaB是HMGB1的抑制剂，NaB可通过抑制脱乙酰基酶，引起高乙酰化HMGB1在细胞中聚集，从而被溶酶体摄取分解并排入胞外，减少HMGB1的产生和释放，下调其基因的表达[7]。HMGB1可以激活p38、JNK、和p42/p44等MAPK信号通路，继而激活MMP-2、MMP-9，使得细胞外基质降解，促进肿瘤浸润和迁移。HMGB1是模式识别受体(toll-like receptor,TLRs)的内源性配体，当大鼠缺乏TLR4就会减少发展为肠内肿瘤的风险，且TLR4在人类许多肿瘤中过表达[8]。在本实验中，RT-PCR和Western Blot分别从基因和蛋白两个不同的角度检测不同浓度NaB作用ACC-2细胞后HMGB1和TLR4的表达，得到了一致的结果：较高浓度的NaB作用于ACC-2时，可以降低HMGB1和TLR4 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)；通过HMGB1与TLR4蛋白相关分析显示：两者为正相关，提示TLR4的表达是随着HMGB1表达的减少而减少,HMGB1与TLR4蛋白线性相关系数r=0.810(P<0.05)，说明两者关系较为密切，TLR4是能与HMGB1结合的受体之一，他们的结合能调节血管内皮生长因子，增加血管密度，从而促进肿瘤的发展[9]。所以NaB抑制HMGB1表达从而改变ACC细胞体外生物学行为，可能是通过与其受体TLR4结合来实现的。

综上所述，正丁酸钠作为一种结肠内的天然副产物，其毒副作用小，并且可以抑制人体诸多肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，有望成为一种新型化疗药物。

参考文献

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The effect and mechanism of sodium butyrate on the invasion and migration in human salivary gland adenoid cystic carcinoma cell line ACC-2*

WangYue1,WuJuanjuan2,LiuXin1,LiYijie1,WangYu1,WeiDan1,SongQi1,LiPing1△

(1.DepartmentofOralHistopathology,ZunyiMedicalUniversity,Zunyi，Guizhou563000,China；2.DepartmentofOralPreventive,GuiyangStomatologicalHospital,Guiyang，Guizhou550000,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of sodium butyrate on the invasion and migration of human salivary gland adenoid cystic carcinoma cell line ACC-2 in vitro and to investigate the underlying mechanisms.MethodsThe cultured ACC-2 cells were treated with different concentrations of sodium butyrate for 24 h,and detected the viability rate of the cells by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay;the drug′s influence on invasion and migration on ACC-2 were detected by Transwell experiment,while the protein and mRNA expression of HMGB1 and TLR4 explored by Western-blot and RT-PCR assay;the relationship between TLR4 expression and HMGB1 was investigated.ResultsCompared with control group,0.625,1.250,2.500,5.000,10.000 mmol/L groups of sodium butyrate inhibited the proliferation of ACC-2 cells(P<0.05);the influence of sodium butyrate on the invasion of ACC-2 cells of all groups had no significant difference(P>0.05);only 2.500,5.000 and 10.000 mmol/L groups inhibited ACC-2 cells migration and down-regulated the protein and mRNA of HMGB1 and TLR4(P<0.05).Correlation analysis showed a positive correlation between the TLR4 protein and HMGB1 protein(r=0.810，P<0.05).ConclusionSodium butyrate could inhibit ACC-2 cells proliferation and high concentration gropes inhibit ACC-2 cells migration,while reducing HMGB1 and TLR4 mRNA and protein expression,suggesting that NaB might inhibite ACC-2 cells migration through down-regulated the mRNA and protein expression.

[Key words]salivary gland neoplasms;carcinoma,adenoid cystic；sodium butyrate；high mobility group box-1；toll like receptor-4；invasion；migration

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.03.014

*基金项目：遵义市汇川区科技局红花岗科技局项目[遵红科合社字(2013)16号];遵义医学院研究生教育创新计划项目[遵研创合CX字(2013)13号]。 遵义市汇川区科技局红花岗科技局项目[遵红科合社字(2013)16号];遵义医学院研究生教育创新计划项目[遵研创合CX字(2013)13号]。作者介绍：王越(1989-)，在读硕士，主要从事口腔颌面部肿瘤研究。

[中图分类号]R73-37

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)03-0332-04

(收稿日期：2015-08-25修回日期：2015-10-20)

作者介绍：王越(1989-)，在读硕士，主要从事口腔颌面部肿瘤研究。

△通讯作者，E-mail:391613734@qq.com。

△通讯作者，E-mail:391613734@qq.com。