银纳米颗粒对胆固醇荧光的增强效用研究

王静静，吴 莹，刘 莹，蔡廷栋，孙 松

江苏师范大学物理与电子工程学院，江苏 徐州 221116

银纳米颗粒对胆固醇荧光的增强效用研究

王静静，吴 莹，刘 莹*，蔡廷栋，孙 松

江苏师范大学物理与电子工程学院，江苏 徐州 221116

在传统荧光光谱技术的基础上，结合金属纳米颗粒的增强荧光技术，探索提高荧光光谱技术检测人全血溶液中胆固醇含量的精度和分辨率的方法。实验研究方面，采用波长为407 nm的激光作为激发光，照射加入一定量银纳米颗粒作为荧光增强剂的人全血溶液，研究了银纳米颗粒对人全血溶液在可见光波段的荧光增强作用。结果表明，胶体状态的银纳米颗粒可以显著增强低浓度的人全血溶液荧光光谱的强度，且不同位置荧光发射峰的荧光增强效率随银胶加入量的增加均呈现先增后减的趋势，但不同峰位置的最强增强效率对应的银胶加入量不同。理论分析方面，根据实验结果及胆固醇分子和银纳米颗粒在溶液中的分布情况，建立了分子间距模型，并根据模型计算得出胆固醇分子和银纳米粒子之间的最佳增强荧光效果间距在12.19～25 nm范围内，这个结果和其他文献中的理论值吻合较好。综上所述，使用银纳米颗粒可实现全血溶液荧光的增强，研究结果为提高检测血液中多种物质的灵敏度和精度提供了有价值的参考作用。

光谱学；荧光增强；银纳米微粒；胆固醇；全血溶液

引 言

胆固醇是人体血液中脂类物质的主要成分之一，是参与合成细胞膜和维生素D、胆汁酸及多种激素的重要物质，对维持人体正常的生理功能具有重要意义。健康的机体需要胆固醇含量适中，精确测量或者动态监测血液中胆固醇的含量非常重要。现在临床常用的监测血液中胆固醇含量的方法有很多，如酶反应法、气相色谱质谱法和液相色谱质谱法[1]。但传统的检测技术均不能兼具操作简单、快速、灵敏度高、对样品无损伤等优点，因此亟需寻找一种集这几种优点于一体的检测方法。

荧光光谱分析技术具有高灵敏度、高精度、检测速度快等优点，已经应用到血液成分检测分析的研究中。但传统的荧光光谱检测方法在检测一些物质时仍然存在一定的局限性，通过查阅文献和实验研究，发现由于在较高浓度的血液荧光光谱实验中，血红蛋白等物质在600 nm左右具有较强的荧光发射峰[2-4]；在较低浓度的血液荧光光谱实验中，水在473 nm有很强的发射峰。这两个峰都是很强的发射峰，有可能掩盖了血液中其他生物分子的荧光，如兰秀风等采用波长为410 nm的激光作为激发光，对含有不同量胆固醇的血清进行光谱实验，发现高胆固醇血清在560 nm处有很明显的荧光发射峰，且发射峰的强度随胆固醇浓度的变化呈现出有规律的变化。而大量全血溶液的荧光光谱试验[2-4]中在560 nm处的峰并不明显，这会直接影响利用荧光光谱技术检测血液中胆固醇含量的监测结果。

大量研究表明[5-6]，纳米量级的金属颗粒在特殊的表面等离子体共振作用下可以增强粒子表面的局域电磁场，影响吸附于颗粒表面及周围荧光团的自由空间条件，进而可以增强一些物质的荧光光谱、表面等离子体共振谱或表面增强拉曼散射谱，增强的光谱效应可显著提高光谱检测的灵敏度。应用金属纳米粒子实现的荧光光谱增强技术发展迅速，并在生物医学领域得到了广泛的应用，Lakowicz等[7]利用纳米尺寸的银岛接近DNA分子，实现了DNA荧光峰的荧光强度增强。因此我们在荧光光谱技术的基础上引入金属纳米微粒增强荧光的技术，希望可以消除或减弱600 nm左右和473 nm处的强发射峰对胆固醇荧光的影响。基于银纳米颗粒对全血溶液的荧光增强，研究了血液中胆固醇的荧光增强效果，计算了利用银纳米荧光增强胆固醇血液荧光的最佳距离范围。

1 实验部分

实验中采用化学还原法制备得到银胶(AgNPs)，以柠檬酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)作为还原剂还原硝酸银溶液(AgNO3)，柠檬酸钠同时兼做稳定剂。实验中使用的柠檬酸钠和AgNO3溶液均为分析纯。实验得到的银胶中银纳米颗粒的均一性较好，形貌近似圆形，半径(r)大小在20～30 nm范围内，平均半径大小约为24.5 nm。

实验所用血样来自医院检验科的健康成人体检血样，置于血常规管(K2EDTA)中低温保存。人全血溶液配制中，采用同一人的同一次采集的血样样本，以医用标准生理盐水作为溶剂。在加入银胶的荧光增强实验中，为了消除加入银胶溶液对血样浓度的影响，固定每份样品的体积为2 mL，具体配制方法如表1。

实验所用主要仪器为Edinburgh Instruments公司生产的FLS920型多功能型光谱仪，激发光光源为输出波长407 nm的PDL800-B型皮秒脉冲半导体激光器。扫描450～750 nm范围内的样品发射光谱。

2 结果与讨论

2.1 正常全血溶液的荧光光谱

采用波长为407 nm的激发光激发正常全血溶液，获得荧光光谱图如图1所示。为了对比实验，实验中共整理出6份不同浓度的全血溶液的荧光光谱：0.4%，0.8%，1.5%，4%，7%和10%的全血溶液，其中这6份血样来自同一人的同一次采血。由图1可知，当全血溶液浓度较低时(浓度小于1%)，荧光光谱中会出现4个很明显的峰，峰值分别位于473，515，560和596 nm左右。而当全血溶液的浓度较高时，荧光光谱在515，560和600 nm左右有3个比较明显的峰，且600 nm左右的峰最强，其他两个很弱。另外，在600 nm左右的荧光发射峰随着血液浓度的增大，发射峰强度先增强后减弱并发生明显的红移，在血液浓度由0.4%增至10%的过程中，其峰位置由596 nm移至629 nm。这处发射峰的宽度范围也很大，从577～700 nm。有文献表明锌卟啉在590 nm处有一个发射峰，原卟啉在630和690 nm处有两个发射峰[8]。因此600 nm附近较强的荧光峰应该是由这一范围内多个荧光发射峰的叠加而成。随着血液浓度的增加，不同位置的荧光发射峰的增减幅度不同，导致其峰强度相互叠加的结果发生了红移。

Fig.1 Fluorescence spectra of human blood solution by different concentration

采用同样的方法也测量了蒸馏水和生理盐水的荧光光谱，如图2所示。从图2可以看出，473 nm处的发射峰应该是来自于水，通过计算得出473 nm位置的波数为3 428 cm-1，调研发现水分子O—H键伸缩振动的拉曼散射峰在3 430 cm-1[9]左右，说明473 nm处的发射峰是水分子O—H键伸缩振动的拉曼峰。

Fig.2 Fluorescence spectra of distilled water and physiological saline

综上所述，低浓度的全血溶液具有较丰富的荧光发射峰，且胆固醇在560 nm处的荧光发射峰较明显，因此实验中主要采用低浓度的全血溶液进行荧光增强实验。

2.2 人全血溶液的荧光增强光谱研究

2.2.1 人全血溶液的吸收光谱

实验中也测量了银胶的吸收光谱如图3所示。从图3可以看出，银胶在350～550 nm范围内有一吸收带，峰位置在430 nm处，为银胶的表面等离子体共振波长，分析认为制备银纳米颗粒大小不均匀，银纳米颗粒的吸收峰随颗粒尺寸的增加发生了红移形成这一较宽的吸收带。

Fig.3 Absorption spectra of colloidal silver solution

测量0.4%全血溶液的吸收光谱如图4所示。从图4可以看出，全血溶液有5个吸收峰，份别位于277，344，417，542和577 nm处，其中417 nm处最强，约为3.14%；542和577 nm处很弱，仅有1.6%左右。调研发现高胆固醇血清在560 nm处有很明显的荧光发射峰[10]，且发射峰的强度随浓度的变化呈现出有规律的变化，在本实验中也发现560 nm处有一个发射峰的强度随胆固醇浓度的变化呈现出有规律的变化，因此认为在本实验中560 nm处的峰为全血溶液中胆固醇的荧光发射峰，而不是全血溶液在542和577 nm处的吸收造成的假峰。

Fig.4 Absorption spectra of 0.4% blood solution

2.2.2 人全血溶液的荧光增强光谱

为了详细研究加入不同量的银纳米颗粒对全血溶液中胆固醇成分荧光增强效果，特对加入不同量银胶的0.4%全血样品进行了比对实验，荧光增强实验中样品具体制备方法参照表一。进行荧光光谱测量时，同组实验中采用相同的扫描参数。

Table 1 Sample preparation table for fluorescence enhancement test of 0.4% whole blood solution

样品编号银胶/mL生理盐水/mL全血原液/μL样品总量/mL101.9928220.41.5928230.51.49282……………151.70.29282161.80.19282171.90.09282

获得表1中1—17号样品的荧光增强光谱图如图5(为了观察清晰，这里只列出部分光谱)，其中光谱峰位于473，515，560，597 nm的四个峰位置几乎没有变化，但是相对图5中0.4%全血溶液光谱的几个峰的相对强度发生明显地变化。

Fig.5 Contrast figure of enhanced 0.4% whole blood solution fluorescence

2.3 分析

为了清晰表达银胶加入量与荧光增强效果的关系，图6给出了560 nm处的荧光增强率随将银胶加入量变化关系曲线。其中荧光增强倍率是通过式(1)得到的，公式中IA为加入一定银胶量的全血样品在560 nm处的荧光发射峰强度，IB为纯0.4%全血溶液在560 nm处的荧光发射峰的强度。

(1)

Fig.6 Relationship between fluorescence enhancement effect of cholesterol and the amount of colloidal silver

从图6可以看出，当加入银胶量在0.4～1.9 mL范围内，银胶对胆固醇在560 nm处的荧光增强效果先增后减，当银胶加入量在0.9 mL左右时，荧光增强率达到最大，其增强倍率约为5.3。金属纳米粒子增强荧光的效果受到许多因素的影响[12]，分析发现在本实验中涉及到的两个主要因素为：一是荧光团的吸收峰和发射峰与金属纳米粒子的表面等离子体共振峰的峰位置关系；二是荧光团与金属纳米粒子之间的距离。下面具体分析这两因素个的影响。

金属纳米微粒增强荧光的途径主要有两种：(1)金属纳米微粒的表面等离子体共振增强局域电磁场，局域电磁场增加荧光团的激发率。理论上，金属纳米微粒的表面等离子体共振波长与荧光团的吸收带重合时，可以获得较好的荧光增强效果[13]。(2)局域电磁场的存在引起荧光量子产率的增加，提高了荧光分子的辐射衰减率。这种机制的荧光增强需要金属纳米微粒的表面等离子体共振波长与荧光分子的发射带一致[14]。实验中，银胶的吸收峰在430 nm左右，吸收带为350～550 nm，而低浓度的人全血溶液的最强吸收峰420 nm也在这一范围内(参考图3和图4)，即全血溶液的吸收带与银纳米颗粒的表面等离子体共振波长有重合，这就为银纳米颗粒增强全血溶液的荧光发射峰提供了理论依据。

表面等离子体共振产生的局域电磁场的大小受金属的种类、金属纳米微粒的尺寸和形态、纳米微粒与荧光团之间的距离等因素的影响。而在本实验中，前几种影响因素均是不变的，只有金属纳米微粒与荧光团的距离会因银胶加入量的不同而有所变化。金属微粒与荧光团之间的距离影响荧光团的跃迁方式[14]，随着银胶加入的量的增加或者血样浓度的增加，银纳米粒子与血液中各种荧光团的之间的距离d会逐步减小。当距离d大于30 nm时，金属纳米粒子对荧光团的影响非常小。当d在5～25 nm范围内，易产生有效的荧光增强，其中5 nm

假设在全血溶液中，胆固醇分子和银纳米颗粒都是均匀分布在溶液中的，建立这种粒子分布模型如图7，根据模型计算最佳增强距离D的范围。

Fig.7 Cholesterol molecular distribution model diagram

由图7可以看出，若粒子之间的平均距离为a，则平均每个粒子占据的空间体积为A=a3。

已知正常人体血清中胆固醇的含量为3.2～5.7 mmol·L-1，在正常人全血溶液中红细胞比积为37%～50%，则通过计算可以得到正常人全血溶液中胆固醇的含量为1.6～3.59 mmol·L-1，使M1=1.6 mmol·L-1和M2=3.59 mmol·L-1，则全血溶液中胆固醇分子的密度为

ρ=M×ћ

(2)

(3)

则胆固醇分子间的平均距离为

(4)

建立胆固醇分子与银纳米颗粒的分布关系模型如图8，并计算胆固醇分子到银纳米颗粒表面的距离d。

Fig.8 Cholesterol molecules and silver nanoparticles distribution model diagram

从图8可以看出，胆固醇到银纳米颗粒表面的距离可表示为

(5)

已由式(4)得出a=63.788 3～48.720 3 nm，已知r=20～30 nm，利用式(5)得到胆固醇到银纳米颗粒表面的距离d的上下限为：d1=35.24 nm和d2=12.19 nm。因为金属纳米粒子对荧光团的荧光增强作用在d>25 nm之后逐渐减小，在d>30 nm之后几乎对荧光团的荧光几乎没有影响，则银纳米颗粒对胆固醇的最佳增强距离应该在12.19～25 nm范围内，荧光增强机制主要是胆固醇荧光团的辐射衰减率被银纳米颗粒增加，也可能存在胆固醇荧光分子的激发效率得到了提高。

3 结 论

(1)银纳米颗粒对人全血溶液具有明显的荧光增强效应。其中对人全血溶液中胆固醇荧光峰产生了明显增强。

(2)全血溶液的吸收带与银纳米颗粒的表面等离子体共振波长有很好的重合，血液荧光增强存在银纳米颗粒产生的局域电磁场增加荧光团的激发率的机制。

(3)适当银胶的加入对低浓度的血液荧光光谱中的胆固醇荧光发射峰起到了荧光增强的作用。随着银胶加入量的增加，对胆固醇荧光的增强效果呈先增后减的趋势，当银胶加入量在0.9 mL左右时达到最佳的荧光增强效果。

(4)经过模拟分析和理论计算得出，银纳米颗粒对胆固醇的荧光增强距离在12.19～25 nm范围内，荧光增强机制主要是银纳米颗粒增加了胆固醇荧光团的辐射衰减率。

研究结果对进一步提高胆固醇荧光检测灵敏度，扩大荧光技术的应用范围提供了更多的可能，为金属荧光增强技术进一步应用于提高血液荧光检测的研究提供了参考。金属增强荧光技术在理论上还有待进一步完善和实验验证，可以通过建立合理的理论模型、利用数值计算等多种手段深入研究金属增强荧光的规律，进一步扩大金属纳米微粒增强荧光的应用范围。

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*Corresponding author

Research on the Fluorescence Enhancement Effect of Silver Nanoparticles on the Cholesterol

WANG Jing-jing，WU Ying，LIU Ying*，CAI Ting-dong，SUN Song

College of Physics & Electronic Engineering, Jiangsu Normal University, Xuzhou, 221116, China

Based on traditional fluorescence spectroscopy and metal nanoparticles-enhanced fluorescence technology, this research explores a method of improving the accuracy and resolution of cholesterol detected by fluorescence spectroscopy in human whole blood solution. In experiment, an adult blood with silver nanoparticles is radiated by a laser pulse with wavelength of 407 nm, the fluorescence enhancement effect of cholesterol in blood is studied. The results show that, colloidal silver nanoparticles can enhance the fluorescence intensity of cholesterol in human blood with low concentration significantly. With the increase of the amount of silver colloids, the enhanced efficiency of fluorescence peaks at different positions increases first, and then decreases. However, the strongest enhanced efficiency of fluorescence peaks is different corresponding to different amount of silver colloids. According to the experimental results and the distribution of cholesterol molecules and silver nanoparticles in solution, molecular spatial distribution model is established by theoretical analyses, and the optimal distance for efficient fluorescence enhancement between cholesterol molecules and silver nanoparticles is calculated, the range is 12.19～25 nm, and the result is in good agreement with the theoretical values in other literatures. In summary, the fluorescence intensity of cholesterol in human blood can be enhanced by colloidal silver nanoparticles, and the results also provide a valuable reference on improving the sensitivity and accuracy of cholesterol detection.

Spectroscopy; Fluorescence enhancement; Silver nanoparticles; Cholesterol; Whole blood

Sep. 29, 2014; accepted Dec. 16, 2014)

2014-09-29，

2014-12-16

国家自然科学基金项目(11104237)资助

王静静，女，1988年生，江苏师范大学硕士研究生 e-mail：jing1368518@163.com *通讯联系人 e-mail：liuying70@126.com

O433

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0140-06