药用植物川东獐牙菜红外光谱分析与鉴别

狄 准，赵艳丽，左智天，龙 华，张 雪，王元忠*，李 鹂*

1. 吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000 2. 云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200 3. 云南技师学院，云南 安宁 650300

药用植物川东獐牙菜红外光谱分析与鉴别

狄 准1, 2，赵艳丽2，左智天2，龙 华1，张 雪3，王元忠2*，李 鹂1*

1. 吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000 2. 云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650200 3. 云南技师学院，云南 安宁 650300

采用傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、偏最小二乘判别分析(partial least square discriminant analysis, PLS-DA)和系统聚类分析(hierarchical cluster analysis, HCA)快速鉴别不同产地川东獐牙菜(SwertiadavidiFranch)。采集4个不同地区70株样品不同部位的红外光谱数据，原始光谱数据经预处理(自动基线校正，自动平滑，一阶求导，二阶求导)后导入OMNIC 8.2，比较吸收峰的差异； 用SIMCA-Pa+10.0进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，以前三个主成分三维得分图比较产地鉴别效果； 红外光谱数据导入SPSS 19.0，进行系统聚类分析(HCA)，通过树状图比较不同部位分类效果。结果显示，(1)不同产地根的光谱图在1 739，1 647，1 614，1 503，1 271，1 243，1 072 cm-1附近的吸收峰有差异，不同产地茎的光谱图在1 503，1 270，1 246 cm-1吸收峰附近有差异； (2)相同产地不同部位的光谱特征峰有差异； (3)PLS-DA分析结果显示自动基线校正+自动平滑+二阶求导这种预处理方式分类效果最好，根的红外光谱数据产地鉴别效果最佳； (4)HCA的树状图，显示根的聚类分析结果正确率83%，茎的聚类分析结果正确率49%，叶的聚类分析结果正确率70%。FTIR技术结合PLS-DA与HCA方法能够快速准确地鉴别不同产地川东獐牙菜，不同部位产地鉴别效果有差异，根的光谱数据产地鉴别效果最佳，二阶求导处理增强了样品的特异性，使PLS-DA的三维主成分得分图分类效果更明显。

红外光谱； 产地鉴别； 川东獐牙菜； 系统聚类分析； 偏最小二乘判别分析

引 言

川东獐牙菜(SwertiadavidiFranch.)为龙胆科獐牙菜属多年生草本植物[1]，俗称鱼胆草、水黄连、水灵芝，为我国特有的獐牙菜属植物，主要分布于川、湘、鄂、黔等地[2]。川东獐牙菜的主要药用成分有獐牙菜苦苷、苦龙胆酯苷、龙胆苦苷等，具有清热解毒、清肝利胆、防治肿瘤等[3]功效，民间将其晒干冲泡饮用，用于治疗痢疾、口腔溃疡。

药用植物鉴别是保证药材品质的关键，不同的产地环境会影响药材的药效和药性[4]。传统药用植物的鉴别技术有色谱鉴别[5-6]、显微鉴别[7]、分子鉴别[8]等，色谱鉴别方法预处理过程会破坏样品，显微鉴别难以区分不同产地同一物种，分子鉴别操作步骤繁琐，对操作技术要求高。傅里叶变换红外光谱法具有操作简便、快速、样品无损的特点[9]，广泛应用于药用植物种类、产地鉴别。Zhao等[10]将近红外光谱与高效液相色谱结合区分不同产地和不同种类的重楼，Li等[11]结合二阶求导与二维相关红外光谱方法鉴别不同种类的当归，Fan等[12]运用FTIR技术，结合PLS-DA和PCA两种方法区分不同产地天麻。

目前，獐牙菜属植物的研究重点主要集中在元素测定、化学成分对疾病的作用、獐牙菜种类鉴别和植物组织培养等方面。Negi[13]研究不同海拔、不同季节影响下宽丝獐牙菜中根与叶的无机元素，Wang等[14]研究大籽獐牙菜对糖尿病鼠类的治疗作用，Wan等[15]研究贵州獐牙菜乙醇提取物对糖尿病的作用，Pandey等[16]比较芒果苷的含量以区分五种獐牙菜，Tao等[17]研究川西獐牙菜愈伤组织如何有效再生，獐牙菜药用植物产地鉴别方面鲜有报道。本研究运用FTIR技术结合PLS-DA与HCA方法，迅速准确地鉴别川东獐牙菜的产地，为该药用植物提供了一种简单易行的产地鉴别方法。

1 实验部分

1.1 材料

供试材料于2014年7月—8月采集，经吉首大学生物资源与环境科学学院李鹂教授鉴定为川东獐牙菜SwertiadavidiFranch.，标本存放于吉首大学生物资源与环境科学学院植物标本馆(标本号为201408011)，样品信息见表1。

Table 1 Information of samples

1.2 仪器

Frontier型傅里叶变换红外光谱仪(Perkin Elmer公司)，配备DTGS检测器； FW-100型高速万能粉碎机(天津市华鑫仪器厂)； 60目标准筛(浙江上虞市道墟五四仪器厂)； YP-2型压片机(上海市山岳科学仪器有限公司)； XS125A型电子分析天平(瑞士Precisa公司)； 溴化钾(分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司)； SPSS 19.0分析软件； SIMCA-P+10.0分析软件； OMNIC 8.2分析软件。

1.3 样品制备

植株清洗干净，将根、茎、叶分开保存，长溪村居群(W1)第1株植物的根标记为W1-1-1，茎标记为W1-1-2，叶标记为W1-1-3，以此类推，阴干。粉碎，过60目筛，备用。精确称取样品粉末1.0 mg，与KBr按1∶50的比例在研钵中混匀，压片。

1.4 光谱数据处理

扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描信号累加16次。原始图谱由OMNIC 8.2分析软件预处理。将自动平滑+自动基线校正图谱，自动平滑+自动基线校正+一阶求导图谱，自动平滑+自动基线校正+二阶求导图谱数据导入SIMCA-P+10.0进行PLS-DA； 数据导入SPSS 19.0进行HCA，距离计算方式： 欧氏距离的平方(Squared Euclidean distance)，聚类方法： 离差平方和法(Ward’s method)。

1.5 方法

1.5.1 重现性试验

随机抽取W1样品，精确称取1.0 mg样品6份，与KBr按1∶50比例混合，分别压片、测定、采集光谱数据。用OMNIC 8.2分析软件测得相似度为99.94%，99.94%，99.72%，99.81%，99.94%，99.61%，RSD为0.14%，以前的工作表明实验方法的重现性好。

1.5.2 精密度试验

按照1.5.1的方法制备1份压片，连续测量6次，采集光谱数据。测得光谱图的相似度为99.98%，100%，100%，100%，100%，99.96%，RSD为0.017%，表明仪器的精密度高。

1.5.3 稳定性试验

按照1.5.1的方法制备1份压片，每隔10 min测定一次，每次测完后放在红外灯下，防止吸潮，测6次，采集光谱数据。测得相似度分别为99.98%，99.77%，99.99%，99.99%，99.98%，99.97%，RSD为0.01%，表明实验方法稳定性好。

2 结果与讨论

2.1 平均光谱图比较

Fig.1 Averaged infrared spectra of S. davidiroots from different origins

Fig.2 Averaged infrared spectra of S. davidistems from different origins

Table 2 Wave numbers of the FTIR fingerprint spectra of the roots

注： 同一列为共有峰

Table 3 Wave numbers of the FTIR fingerprint spectra of the stems

注： 同一列为共有峰

Table 4 Wave numbers of the FTIR fingerprint spectra of the leaves

注： 同一列为共有峰

2.2 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)

原始光谱经预处理后导入SIMCA-P+10.0软件，进行PLS-DA分析，结果见图4。4(a)： 自动平滑+自动基线校正预处理，4个产地样品不能很好的分开，相互重叠在一起； 4(b)： 自动平滑+自动基线校正+一阶求导预处理，相同居群聚在一起，不同居群分开； 4(c)： 经过自动平滑+自动基线校正+二阶求导预处理，分类效果最好，即根的产地鉴别效果明显优于茎与叶。二阶求导能有效地消除了其他背景干扰，增强样品之间的特异性[19]，二阶求导处理后的PLS-DA三维得分图，可以准确鉴别样品产地。

2.3 系统聚类分析

系统聚类分析的基本思想是根据一定的标准，通过相应的方法，把相似元素归结为一类[20]。系统聚类分析鉴别4个产地的川东獐牙菜，朱砂村居群(J1，1-20)，永定区居群(M1，21-40)，长溪村居群(W1，41-60)，鹿角镇居群(W2，61-70)，以距离3划分，结果显示相同部位不同处理方式的分类效果有差异： 根(自动平滑+自动基线校正+二阶求导>自动平滑+自动基线校正+一阶求导>自动平滑+自动基线校正)，茎(自动平滑+自动基线校正+一阶求导>自动平滑+自动基线校正>自动平滑+自动基线校正+二阶求导)，叶(自动平滑+自动基线校正+二阶求导>自动平滑+自动基线校正+一阶求导>自动平滑+自动基线校正)。图5为不同部位系统聚类树状图比较，d1为根(自动平滑+自动基线校正+二阶求导)，d2为茎(自动平滑+自动基线校正+一阶求导)，d3为叶(自动平滑+自动基线校正+二阶求导)。在树状图中将每一类标记，注明不同产地样品个数，由图5得知，d1误判个数为12，正确率为83%； d2误判个数为36，正确率为49%； d3误判个数为21，正确率为70%。不同产地之间以根的红外光谱数据作为产地鉴别的依据，效果最好。

Fig.4 3D score scatter plot

Fig.5 Comparison of the best dendrogram of different parts

3 结 论

使用OMNIC 8.0软件比较4个不同产地川东獐牙菜不同部位平均光谱图，结果显示相同产地不同部位的红外光谱特征峰有差异，可能是因为不同部位化学物质成分和含量不同，4个产地川东獐牙菜根之间，茎之间的吸收峰不同，这可能与不同产地环境因素和植株本身遗传因素有关； 自动平滑+自动基线校正+二阶求导处理后的PLS-DA三维得分图将4个不同产地川东獐牙菜分开，根的分类效果比茎、叶的效果好，表明不同部位之间分类效果有差异，产地鉴别效果与处理方式有关； HCA树状图分类结果显示根的正确率为83%，茎的正确率为49%，叶的正确率为70%，表明根的分类效果最好，茎的分类效果最差。因此FTIR与PLS-DA和HCA方法结合对川东獐牙菜进行产地鉴别的方法可行。

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*Corresponding authors

Analysis and Discrimination of the Medicinal PlantsSwertiaDavidiFranch Based on Infrared Spectroscopy

DI Zhun1, 2, ZHAO Yan-li2, ZUO Zhi-tian2, LONG Hua1, ZHANG Xue3, WANG Yuan-zhong2*, LI Li1*

1. Resources and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou 416000, China 2. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kuming 650200, China 3. Yunnan Technician College, Anning 650300, China

Fourier transform infrared spectroscopy combined with partial least squares discriminate analysis (PLS-DA) and hierarchical cluster analysis (HCA) were used to rapidly discriminate theSwertiadavidiFranch which collected from different origins. The original infrared spectra data of different parts of all the 70 samples which collected from four different regions were preprocessed by automatic calibration, automatic smoothing, the first derivative and the second derivative. Then the processed data were imported into OMNIC 8.2 and the absorption peaks were compared; PLS-DA was performed by SIMCA-P+10.0 and the effect of discrimination of different origins was compared by 3D score plot of the first three principal components; the infrared spectral data were imported into SPSS 19.0 for HCA to compare classification results of different parts by the dendrogram. The results showed that: (1) There were differences among the spectra of the roots of different origins in the spectral peaks in 1 739, 1 647, 1 614, 1 503, 1 271, 1 243, 1 072 cm-1. The spectra of the stems of different origins showed differentiation in the wavelength in 1 503, 1 270, 1 246 cm-1; (2) The characteristic peaks of different parts of the same origin were different; (3) PLS-DA indicated that the data which were processed by automatic correction, automatic smoothing and second derivative have showed the best classification. In addition, the discrimination of roots which collected from different origins could be the best; (4) Tree diagram of HCA showed that the accuracy rate of cluster in roots, stems and leaves were 83%, 56%, and 70%, respectively. In conclusion: FTIR combined with PLS-DA and HCA can rapidly and accurately differentiate S. davidi that collected from different origins, the origin discrimination effect of different parts was clearly different that the classification of roots is the best, the second derivative could enhance the specificity of the samples, the classification in 3D score plot could be visualized and obvious.

Infrared spectroscopy; Origin discrimination;SwertiadavidiFranch; Hierarchical cluster analysis; Partial least squares discriminant analysis

Sep. 28, 2014; accepted Jan. 18, 2015)

2014-09-28，

2015-01-18

国家自然科学基金项目(31260102, 81260608)资助

狄 准，1989年生，吉首大学生物资源与环境科学学院硕士研究生 e-mail： dizhun@hotmail.com *通讯联系人 e-mail: yzwang1981@126.com; lilyjsu@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)02-0388-06