MTHFR基因多态性与非综合征性唇腭裂的相关性研究

安　乐　焦晓辉　米　娜　郝嫣汝　宋红权

(哈尔滨医科大学，哈尔滨150000)



MTHFR基因多态性与非综合征性唇腭裂的相关性研究

安乐①焦晓辉①米娜郝嫣汝宋红权②

(哈尔滨医科大学，哈尔滨150000)

[摘要]目的：探讨5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与非综合征性唇腭裂(NSCLP)遗传易感性的相关性。方法：选取2014年6月至2015年5月在我院治疗的NSCLP患者100例(病例组A),其中单纯性腭裂(CPO组)23例，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P组)77例；同时选取100名正常儿童(对照组A)、100名生育过NSCLP患儿母亲(病例组B)和100名正常出生儿母亲(对照组B)，采用聚合酶联式反应-限制性片段长度多态性基因分型技术检测各组MTHFR基因C677T突变。结果：病例组A中，CL/P组C、T等位基因频率为55.84%和44.16%，CPO组分别为54.35%和45.65%，对照组A分别为75.00%和25.00%，CL/P组和CPO组T等位基因频率明显高于对照组A，差异有统计学意义(P<0.05)；CT基因型个体患CL/P的风险是CC基因型个体的2.39倍，患CPO的风险是CC基因型个体的2.98倍；TT基因型个体患CL/P的风险是CC基因型个体的6.70倍，患CPO的风险是CC基因型个体的7.33倍；病例组B和对照组B的等位基因频率和基因型构成情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：MTHFR基因C677T突变可能是NSCLP发生的遗传危险因素之一，但母亲MTHFR基因C677T突变可能与子代发生NSCLP无关。

[关键词]MTHFR基因；NSCLP；相关性；等位基因

唇腭裂是人类较为常见的先天性发育畸形之一，临床上根据胚胎学发育时期的不同致畸机制，往往将非综合征性唇腭裂分为单纯性唇腭裂和唇裂伴或者不伴腭裂。相关临床统计可见非综合征性唇腭裂占到了唇腭裂发生的75%左右[1]，但相关病因研究尚无明确进展，迄今位置多数学者认为，唇腭裂的发病主要为环境因素与遗传因素相互作用的结果[2,3]。相关国外文献报道认为，孕妇在孕早期叶酸摄入不足会使得胎儿发生非综合症型唇腭裂的几率增加，同时妊娠三个月内服用叶酸拮抗剂如甲氨蝶呤或者苯妥英钠均会不同程度的增加新生儿非综合型唇腭裂的发生[4,5]，提示了叶酸缺乏是导致非综合型唇腭裂的重要原因，本次临床研究重在分析5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与非综合征性唇腭裂(NSCLP)遗传易感性的相关性，具体研究如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象选取2014年6月至2015年5月在我院治疗的非综合征性唇腭裂(NSCLP)患者100例(病例组A)，其中男性58例，女性42例；年龄4个月～18岁，平均(4.71±2.02)岁；其中单纯性腭裂(CPO组)23例，唇裂伴或不伴腭裂(CL/P组)77例，其中双侧CL/P 17例，单侧CL/P 60例。排除综合性唇腭裂或其他系统畸形。病例组B：选取100名生育过NSCLP患儿母亲，年龄23～38岁，平均年龄(28.13±4.58)岁，排除恶性肿瘤、心脑血管方面等疾病。对照组A：选取100名正常儿童，其中男性60例，女性40例，年龄2月～17岁，平均年龄(5.02±2.51)岁，排除其他先天性畸形。对照组B：选取100名正常出生儿母亲，年龄22～38岁，平均年龄(28.01±5.21)岁，排除恶性肿瘤、心脑血管方面等疾病。此次实验通过院内医学伦理委员会的批准，血液标本在研究对象或在其家长的知情同意的前提下获得。

1.1.2仪器和试剂tapDNA聚合酶购自立陶宛MBI公司，hinfⅠ、MboⅡ限制性内切酶购自立陶宛MBI公司，2700型PCR购自美国ABI公司，APPLIGENE垂直电泳槽、H6-1微型电泳槽购自上海福马实验设备有限公司。

1.2实验方法将收集到的5 ml全血，ACD抗凝，提取基因组DNA，应用primer5.0引物设计软件设计引物、内切酶，对于两个位点进行内切，分别应用PCR扩增引物进行限制性内切酶MAV1、DdeⅠ酶切，产物电泳后进行基因分型。为了验证基因分型正确性，随机挑选10%的样本直接测序，同时设立阳性对照炎症内切酶的正确性。

1.3统计学处理数据分析采用SPSS19.0统计软件，C677T基因型及等位基因频率使用χ2检验，C677T基因型与NSCLP相关性采用优势比表示。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1C677T多态性电泳结果DNA片段扩增后长度为198 bp，若发生C→T突变，则产生HinfⅠ酶切位点，产生175 bp和23 bp片段。纯和突变型(TT)产生175 bp，23 bp两个DNA片段，杂合子(CT)产生198、175、23 bp三个DNA片段，野生型(CC)只用198 bp一个DNA片段。以标准分子量Marker为参照，在电泳图谱上可看到CC基因型、CT基因型和TT基因型，见图1。

2.2病例组A与对照组A C677T基因型和等位基因频率比较病例组A中，CL/P组C、T等位基因频率为55.84%和44.16%，CPO组分别为54.35%和45.65%，对照组A分别为75.00%和25.00%，CL/P组和CPO组T等位基因频率明显高于对照组A，差异有统计学意义(χ2=14.367、7.769，P<0.05)；CT基因型个体患CL/P的风险是CC基因型个体的2.39倍，患CPO的风险是CC基因型个体的2.98倍；TT基因型个体患CL/P的风险是CC基因型个体的6.70倍，患CPO的风险是CC基因型个体的7.33倍。见表1。

图1　MTHFR基因C677T多态性电泳结果Fig.1　MTHFR gene C677T polymorphic electrophor-esis resultsNote: 3-6.CC genotype;1,2,8.CT genotype;7.TT genotype;M.Standard molecular weight Marker.

表1病例组A与对照组A C677T基因型和等位基因频率比较[n(%)]

Tab.1Case group A and control group A C677T genotype and allele frequency comparison[n(%)]

GroupnGenotypefrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTCasegroupA10032(32.00)54(54.00)14(14.00)118(59.00)82(41.00)CL/Pgroup7723(29.87)40(51.95)14(18.18)86(55.84)68(44.16)CPOgroup236(26.09)13(56.52)4(17.39)25(54.35)21(45.65)ControlgroupA10055(55.00)40(40.00)5(5.00)150(75.00)50(25.00)

表2病例组B与对照组B C677T基因型和等位基因频率比较[n(%)]

Tab.2Case group B and control group B C677T genotype and allele frequency comparison[n(%)]

GroupsnGenotypefrequencyCCCTTTAllelefrequencyCTCasegroupB10043(43.00)47(47.00)10(10.00)133(66.50)67(33.50)ControlgroupB10039(39.00)50(50.00)11(11.00)128(64.00)72(36.00)

2.3病例组B与对照组B中C677T基因型和等位基因频率比较病例组B的C、T等位基因频率分别为66.50%和33.50%，对照组B的等位基因频率分别为64.00%和36.00%，差异比较无统计学意义(χ2=0.276，P>0.05)；两组基因型构成情况比较差异无统计学意义(χ2=0.336，P>0.05)。见表2。

3讨论

近年来随着先天性唇腭裂相关研究的进展，多数学者认为，先天性基因易感性以及环境因素独立以及相互作用的方式，均可能较为显著地参与到了先天性唇腭裂特别是非综合型唇腭裂的发生中[6]。笔者通过回顾国内外相关文献发现，基础领域的研究着重探讨了基因水平的变异或者易感基因的先天性获得对于唇腭裂的发病影响[7]，古丽等[8]研究者证实，在孕妇怀孕早期(一般认为怀孕3月)，叶酸的摄入不足以及叶酸相关拮抗剂的摄入均在一定程度上增加了新生儿唇腭裂的发生率，但相关临床荟萃分析较少，同时进一步研究并未发现新生儿唇腭裂的发生与叶酸摄入水平存在明显的剂量依赖性[9]。故此，近三年来部分学者通过研究提出叶酸对于唇腭裂的发生影响并不仅仅依靠叶酸摄入水平，更多依靠相关叶酸代谢途径，进而促进部分致畸基因的异常激活，从而增加唇腭裂的发生率[10]，而C677T多态性对于先天性唇腭裂的临床易感性研究较少，本研究重在探讨黑龙江省汉族人群中5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与非综合征性唇腭裂(NSCLP)遗传易感性的相关性，进而为相关流行病学统计以及公共卫生领域分析提供依据。

部分学者在探讨A1298C多态性与先天性非综合型唇腭裂的发生关系中发现，C677正常核型均为677CC，当非综合型唇腭裂易感基因A1298部位核型由A1298AA突变为1298CC时，部分C677核型突变为677TT[11]，提示了C677核型突变可能参与到了非综合型唇腭裂的发生机制中。笔者通过本次研究发现，野生型C677基因有CC突变为杂合型(CT)或者纯核型(TT)，进一步证实了相关学者的提出的假设[12]，表明C677基因多态性可能参与到了非综合型唇腭裂的发生机制中，而进一步分析可见，单纯性唇腭裂以及唇裂伴或者不伴腭裂组T等位基因频率明显高于正常对照人群，而相关基因型分析可见随着C-T基因突变的发生，杂合型突变基因型导致新生儿患非综合型唇腭裂的几率增加了2～3倍，而当C-T突变为纯突变型基因型时，发生两种唇腭裂的可能性显著增加，风险可增加7倍左右，提示了C677基因多态性与非综合型唇腭裂的发生关系， Desai等[13]综合分析后认为，MTHFR基因677C-T或1298A-C突变使控制叶酸代谢的MTHFR蛋白构象发生变化，MTHFR酶活性显著下降，而这一代谢途径对于维持正常血浆5-甲基四氢叶酸和hcy的浓度至关重要，而hcy与颌面部和神经管在胚胎发育上密切相关，细胞内MTHFR基因677C-T突变导致的MTHFR酶活性显著下降，可进一步通过促进细胞内Hey聚集，有可能干扰正常发育的颌面部组织，影响颌面部突起的正常融合，进而导致唇腭裂的发生。但相关先天性唇腭裂畸形新生儿产妇的C677基因并无明显多态性表现，提示母体相关位点基因并未在唇腭裂的发生中发挥作用，同时提示相关唇腭裂新生儿C677位点多态性的获得性发生机制较为少见，多数病例在胚胎发育过程中由于环境或者其他因素进而造成相关位点突变，引起易感基因多态性表现[11]。

综上所述，本研究证明了MTHFR基因C677T突变与NSCLP风险增高显著相关，为叶酸摄入低或叶酸代谢障碍在NSCLP发生中起重要作用的假说提供了遗传学基础。后续相关研究应更加注重MTHFR基因C677T多态性与叶酸摄入量之间的交互作用，并对MTHFR酶活性、血浆hcy水平进行综合分析。

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[收稿2015-09-20修回2015-10-20]

(编辑许四平)

MTHFR gene polymorphism and non syndrome cleft lip and palate correlation study

ANLe，JIAOXiao-Hui,MINa,HAOYan-Ru,SONGHong-Quan.

TheSchoolofDentistryofHarbinMedicalUniversity,Haerbin150000,China

[Abstract]Objective:To investigate 5,10 methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene C677T polymorphism and non syndrome cleft lip and cleft palate (NSCLP) genetic susceptibility correlation.Methods: From June 2014 to May 2015,100 NSCLP patients (case group A) were treated in our hospital,where in cleft palate (CPO group) 23 cases,77 cases of cleft lip with or without cleft palate (CL/P group);at the same time,selected 100 normal children (control group A),100 mothers of NSCLP children (case group B) and 100 normal birth mother (control group B),C677T mutation of MTHFR gene was detected by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism genotyping technique.Results: in case group A,CL/P group C,T allele frequency were 55.84% and 44.16%,CPO group were 54.35% and 45.65%,control group A was 75.00% and 25.00%,CL/P and CPO group T allele frequency was significantly higher group A,the difference was statistically significant (P<0.05);CT genotypes suffering CL/P′s risk was 2.39 times the CC genotype,suffering CPO′s risk was 2.98 times the CC genotype；TT genotypes suffering CL/P′s risk was 6.70 times the CC genotype,suffering CPO′s risk was 7.33 times the CC genotype;there was no significant difference in the allele frequencies and genotype between the case group B and the control group B (P>0.05).Conclusion: C677T mutation of MTHFR gene may be one of the genetic risk factors of NSCLP,but mother MTHFR C677T mutation may unrelated with the offspring NSCLP.

[Key words]MTHFR gene;NSCLP;Relativity;Allele

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.027

作者简介：安乐(1988年-)，男，主要从事唇腭裂发生机制研究。

中图分类号R782.2

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)05-0722-04

①哈尔滨医科大学第一附属口腔医院，哈尔滨150000。

②黑龙江省医院，哈尔滨150000。

通讯作者及指导教师：焦晓辉(1958年-)，男，主任医师，教授，博士生导师，主要从事唇腭裂发生机制研究。