PI3K/AKT信号通路在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468中的作用及三氧化二砷对其的干预作用

郭发爽,李庆华,淮宗让,李席如

(1.解放军159医院乳腺外科,河南驻马店 463000；2.解放军301医院乳腺外科,北京 100000)



PI3K/AKT信号通路在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468中的作用及三氧化二砷对其的干预作用

郭发爽1,李庆华1,淮宗让1,李席如2

(1.解放军159医院乳腺外科,河南驻马店 463000；2.解放军301医院乳腺外科,北京 100000)

[摘要]目的探讨三氧化二砷通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468凋亡的影响。方法实验分为空白对照组，三氧化二砷组(2、4、8 μmol/L)，LY294002组(25 μmol/L)，三氧化二砷(4 μmol/L)联合LY294002(25 μmol/L)组(联合组)；MTT法检测各组细胞活力；流式细胞术检测各组细胞周期；Western blot分析各组PI3K/AKT通路的激活状况及其下游靶分子细胞周期蛋白A1(Cyclin A1)，Cyclin D1，Bax，Bcl-2的表达。结果2、4、8 μmol/L三氧化二砷，LY294002都可显著抑制细胞活力(P<0.05)，并且在48 h抑制程度最高；与对照组比较，4 μmol/L三氧化二砷及LY294002都可使细胞周期阻滞在G1期(P<0.05)，并降低AKT磷酸化水平(P<0.05)，进而下调Cyclin A1，Cyclin D1，Bcl-2的表达(P<0.05)，上调Bax的表达(P<0.05)；三氧化二砷联合LY294002处理MDA-MB-468细胞较药物单独作用效果增强(P<0.05)。结论三氧化二砷及LY294002可通过阻断PI3K/AKT信号通路来诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468凋亡，二者具有协同作用。

[关键词]三氧化二砷；三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468；凋亡；PI3K/AKT信号通路

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升。三阴性乳腺癌是指雌激素、孕激素及原癌基因人类表皮生长因子受体-2均为阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的三分之一，是预后最差的乳腺癌[1]。乳腺癌发病机制复杂，受多种信号通路调控。其中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)与多种人类肿瘤的发生发展密切相关。PI3K/AKT可参与乳腺癌癌细胞的代谢、生长、凋亡，其活性异常可刺激下游信号分子细胞周期蛋白A1(Cyclin A1)、Cyclin D1、Bax及Bcl-2的持续表达，导致乳腺癌细胞的不可控制生长增殖[2]。

三氧化二砷是传统中药砒霜的主要成分，已成为急性早幼粒细胞白血病临床治疗药物，患者复发率低，不良反应轻，与其他化疗药物无交叉耐药。不仅如此，三氧化二砷还可抑制多种实体肿瘤生长，如消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、妇科肿瘤等，其抑制肿瘤的重要机制就是诱导肿瘤细胞凋亡[3]。Guilbert等[4]研究进一步表明二氧化二砷可抑制MDA-MB-468乳腺癌细胞移植瘤的生长，并与雷帕霉素联合使用下调AKT磷酸化水平有关。因此笔者在此基础上，通过体外培养三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468，利用三氧化二砷及LY294002联合或单独处理乳腺癌细胞MDA-MB-468，来探讨三氧化二砷是否通过PI3K/AKT信号通路诱导MDA-MB-468细胞凋亡。

1材料与方法

1.1材料三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468购于中国科学院上海细胞库，目录号TCHu136，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。三氧化二砷粉剂购于北京双鹭药业股份有限公司，批号20101224。细胞周期试剂盒、β-actin、LY294002购自碧云天生物技术研究所；兔抗AKT、p-AKT、Cyclin A1、Cyclin D1、Bax和Bcl-2单克隆抗体购自美国Cell Signaling Techonology；胎牛血清、DMEM培养基、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Gibco公司。

表1　三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞活力抑制率的影响，%)

aa：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.05，与4 μmol/L三氧化二砷组比较；c：P<0.05，与LY294002组比较。

表2　三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞周期的影响，%)

a:P<0.05，与对照组比较，aa：P<0.01；b：P<0.05，与4 μmol/L三氧化二砷组比较；c：P<0.05，与LY294002组比较。

1.2MTT法将处于对数生长期的MDA-MB-468细胞消化，调整细胞浓度接种于37 ℃5% CO2培养箱中培养24 h。加入含5% 胎牛血清的DMEM、三氧化二砷(终浓度2，4，8 μmol/L)及LY294002(25 μmol/L)，继续培养24、48、72 h，加入MTT(5 mg/mL)20 μL，4 h后弃上清液，在每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶标仪570 nm处测定光密度(OD)值。并计算细胞增殖抑制率。

1.3细胞周期检测将处于对数生长期的MDA-MB-468细胞消化，浓度调整为8×103/mL，接种于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养24 h。加入含5% 胎牛血清的DMEM培养基、三氧化二砷(终浓度4 μmol/L)或与LY294002(25 μmol/L)，继续培养48 h，收集细胞。按细胞周期检测试剂盒说明书进行检测。

1.4Western blot按1.3方法接种细胞，培养48 h后，收集细胞，裂解收获蛋白样品。BCA试剂盒检测蛋白浓度、上样，进行SDS凝胶电泳，转膜，封闭，加入一抗4 ℃孵育过夜。次日加二抗孵育后曝光。并用“Quantity one”软件对蛋白灰度值进行统计分析。

2结果

2.1三氧化二砷对MDA-MB-468细胞活力的影响如表1所示，随着作用浓度的增加，三氧化二砷对MDA-MB-468细胞活力抑制作用逐渐增强，在8 μmol/L时，抑制程度最大，差异有统计学意义(P<0.01)；在同一浓度，随着作用时间增加，三氧化二砷对MDA-MB-468细胞活力抑制作用也逐渐增强，在72 h作用强度最大，但48 h与72 h作用程度较为一致；与对照组比较，随着作用时间增加，LY294002组及联合组对MDA-MB-468细胞活力抑制作用也逐渐增强，48 h与72 h作用程度较为一致，因此笔者选取48 h作为后续实验时间。同时发现与4 μmol/L 三氧化二砷组及LY294002组比较，联合组作用效果更强。

2.2三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞周期的影响如表2所示，与对照组比较，LY294002组、4 μmol/L三氧化二砷组及联合组G1期的细胞明显增加，分别为(55.68±4.29)%、(69.51±4.32)%、(68.13±3.67)%、(73.45±6.04)%，差异具有统计学意义(P<0.01)；与LY294002组及4 μmol/L三氧化二砷组比较，联合组G1期的细胞也明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞中磷酸化AKT表达量的影响如图1所示，与对照组相比，4 μmol/L三氧化二砷组及LY294002组中磷酸化AKT水平下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与三氧化二砷组及LY294002组比较，联合组中磷酸化AKT水平下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。

aa:P<0.01,与对照组比较；b:P<0.05,与4 μmol/L三氧化二砷组比较；c:P<0.05,与LY294002组比较。

图1三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞中磷酸化AKT表达量的影响

2.4三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞中Cyclin A1和Cyclin D1蛋白水平的影响如图2所示，与对照组相比，4 μmol/L三氧化二砷组及LY294002组中Cyclin A1和Cyclin D1表达量下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；与4 μmol/L三氧化二砷组及LY294002组比较，联合组中Cyclin A1和Cyclin D1表达量下降，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

a:P<0.05，aa:P<0.01,与对照组比；bb:P<0.01,与4 μmol/L三氧化二砷组比较；c:P<0.05,与LY294002组比较。

图2三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞中Cyclin A1和Cyclin D1蛋白含量的影响

2.5三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞中Bax，Bcl-2蛋白含量的影响如图3所示，与对照组相比，4 μmol/L三氧化二砷组及LY294002组Bcl-2表达量下降，Bax表达量上升，差异具有统计学意义(P<0.01)；与4 μmol/L三氧化二砷组及LY294002组比较，联合组中Bcl-2表达量下降，Bax表达量上升，差异具有统计学意义(P<0.05)。

aa:P<0.01,与对照组比；b:P<0.05，bb:P<0.01,与三氧化二砷组比较；c:P<0.05，cc:P<0.01,与LY294002组比较。

图3三氧化二砷及LY294002对MDA-MB-468细胞中Bax，Bcl-2蛋白含量的影响

3讨论

近年来研究表明，三氧化二砷除了能治疗血液系统疾病，对多种恶性实体瘤也有强大的抗癌作用。如Kasukabe等[5]的研究结果表明三氧化二砷能抑制乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB--231生长。Xia等[5]的研究结果表明三氧化二砷可通过下调Bcl-2表达来抑制乳腺癌细胞生长。Guilbert等[4]研究进一步表明三氧化二砷可抑制MDA-MB-468乳腺癌细胞移植瘤的生长，并与雷帕霉素联合使用下调磷酸化AKT水平有关。因此本研究在此基础上，通过MTT实验发现三氧化二砷可显著抑制MDA-MB-468细胞活力，其作用浓度范围及时间与文献报道较为一致[4-6]。

细胞凋亡障碍导致肿瘤的不可控制增殖，是恶性肿瘤发生发展的一个重要因素。所以，通过某种诱导肿瘤细胞凋亡，则有可能抑制恶性肿瘤的发生和发展。PI3K/AKT通路是细胞内重要的存活信号通路，它可以通过直接或间接调控细胞增殖、分化、凋亡。AKT一旦活化即移动到细胞质和细胞核并调节许多下游靶点，如Cyclin A1，Cyclin D1，Bax，Bcl-2等蛋白的表达，从而调节多种生物学功能[2]。在人乳腺癌组织中磷酸化AKT蛋白表达明显增高，且磷酸化AKT蛋白阳性表达与乳腺癌恶性程度呈正相关[7]。本实验结果也证实了此观点，MDA-MB-468细胞中AKT磷酸化程度显著。LY294002是广泛应用的一种PI3K小分子特异性抑制剂，能大部分抑制PI3K的活性，降低AKT的活化，从而抑制下游事件的发生，导致细胞的增殖减少，并促进其凋亡。LY294002对乳腺癌细胞MDA-MB-468具有生长抑制、凋亡诱导的效应，是通过抑制PI3K和AKT活性实现的[8]。三氧化二砷可通过PI3K/AKT信号通路抑制人胃癌细胞SGC-7901[9]及人肾癌细胞786-O[10]增殖。本实验结果也证实三氧化二砷及LY294002都可降低AKT磷酸化水平，且联合给药优于单独给药。Szegezdi等[11]研究发现在三氧化二砷作用于细胞时，抑制PI3K可以增强三氧化二砷诱导的凋亡，从而进一步说明三氧化二砷与LY294002具有协同作用。

细胞癌变与细胞周期密切相关。多种抗肿瘤药物对细胞周期有特异的阻断作用，导致肿瘤细胞停滞在G1/M期而发挥治疗作用。其中Cyclin D1是与细胞周期G1期紧密相关的细胞周期蛋白，Cyclin D1过表达可缩短细胞周期G1期，促进细胞进入S期，导致细胞过度增殖而发生肿瘤。已报道MDA-MB-468细胞通过PI3K/AKT途径上调Cyclin D1表达，Cyclin D1使细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖[12]。Roszak等[13]研究表明三氧化二砷通过抑制磷酸化AKT水平而下调Jurkat白血病T细胞系中Cyclin D1表达。Wang等[14]的研究显示三氧化二砷使MCF-7细胞阻滞在G1期而发挥其凋亡诱导作用。本实验也证实了三氧化二砷可通过抑制AKT磷酸化，下调Cyclin D1，并使细胞阻滞在G1期。Cyclin A是细胞进入S期的关键细胞周期蛋白，其被抑制表达后，会使进入S期的细胞数目明显减少。Yedjou等[15]研究显示三氧化二砷可抑制人白血病细胞HL-60增殖与下调Cyclin A1表达有关。本实验也证实了三氧化二砷可下调Cyclin A1表达。

分子生物学的手段发现越来越多的癌基因，抑癌基因多与多种肿瘤发生发展密切相关，Bax、Bcl-2是目前公认的参与细胞凋亡调控作用的主要基因。Bcl-2是第一个在淋巴细胞中被发现的能阻断细胞死亡的蛋白。Bax是促凋亡蛋白。研究发现三阴性乳腺癌组织中高表达Bcl-2蛋白[16]。Bax在包括乳腺癌组织等多种肿瘤中表达下降[17]。本研究也证实MDA-MB-468细胞低表达Bax，高表达Bcl-2。三氧化二砷可通过调节Bax及Bcl-2的表达来诱导诱导骨髓增生异常综合征(MDS)SKM-1细胞的凋亡[18]。因此本实验通过三氧化二砷及LY294002作用MDA-MB-468细胞后，发现可显著下调Bcl-2表达，上调Bax的表达，从而诱导MDA-MB-468细胞凋亡，且联合给药优于单独给药。

综上所述，三氧化二砷与LY294002可通过阻断PI3K/AKT信号通路，下调Cyclin A1，Cyclin D1，Bcl-2表达，上调Bax表达，从而诱导MDA-MB-468细胞凋亡，且二者具有协同作用。

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doi:·经验交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.030

作者简介：郭发爽(1982-)，学士，主治医师，主要从事乳腺相关疾病的研究。

[中图分类号]R737.9

[文献标识码]B

[文章编号]1671-8348(2016)08-1091-04

(收稿日期：2015-09-16修回日期：2015-11-04)