胃癌组织中NRP-1的表达与临床病理特征及预后的相关性*

徐卫国，杨少君,王宇鹏,刘　云,张世伟,徐　洪,贾纯亮,孙　红,刘和亮

(1.河北联合大学附属医院肿瘤外科，河北唐山 063000;2.天津市北辰医院肿瘤科　300400;3.河北省廊坊市中医院内科　065000;4.浙江省富阳市人民医院肿瘤外科　311400;5.河北联合大学医学研究实验中学，河北唐山 063000;6.河北省唐山市人民医院胃肠外科　063000;7.河北联合大学基础医学院病理学系，河北唐山 063000)



胃癌组织中NRP-1的表达与临床病理特征及预后的相关性*

徐卫国1，杨少君1,王宇鹏2,刘云3,张世伟4,徐洪5,贾纯亮6,孙红7,刘和亮5

(1.河北联合大学附属医院肿瘤外科，河北唐山 063000;2.天津市北辰医院肿瘤科300400;3.河北省廊坊市中医院内科065000;4.浙江省富阳市人民医院肿瘤外科311400;5.河北联合大学医学研究实验中学，河北唐山 063000;6.河北省唐山市人民医院胃肠外科063000;7.河北联合大学基础医学院病理学系，河北唐山 063000)

[摘要]目的检测胃癌组织中神经纤毛蛋白-1(NRP-1)的表达,分析其与胃癌临床病理特征之间的关系，探讨其对判断胃癌预后的价值。方法回顾性分析168例胃癌患者的临床病理资料及预后情况,采用免疫组化法检测癌组织及相对正常组织NRP-1的表达，研究NRP-1的表达与临床病理及预后之间的关系。结果(1)NRP-1在胃癌组织中表达高于相对正常组织(66.7% vs.8.33%，P<0.05)。(2)NRP-1的表达与肿瘤大小、细胞分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)。(3)NRP-1高表达的患者的生存期短于低表达的患者(中位生存期28个月vs.64个月，P<0.05)。(4)COX比例风险模型进行多因素分析表明，NRP-1的表达为影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)。结论(1)NRP-1在胃癌的发生、发展中起到重要作用，与胃癌的恶性生物学行为密切相关。(2)NRP-1高表达提示预后不良。(3)NRP-1有望作为判断胃癌生物学行为和预后的参考指标。

[关键词]胃肿瘤;预后；神经纤毛蛋白-1

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，在全世界居恶性肿瘤死亡率第2位[1]。我国胃癌的患病率及死亡率均明显高于世界平均水平[2]。由于早期胃癌缺乏典型的临床症状，临床确诊的胃癌病例多为进展期胃癌[3]。导致患者死亡的原因多为肿瘤的复发及转移，而血液转移及淋巴管转移是恶性肿瘤转移的重要途径。神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)于1995年首次被Fujisawa等[4]发现并命名。后被证明NRP-1可与神经轴突导向因子Semaphorin3A(Sema3)结合，在神经发育过程起作用[5]。近来研究表明，NRP-1还可作为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的受体，表达于肿瘤细胞，参与肿瘤细胞的增殖和转移[6]。本文通过观察胃癌组织中NRP-1的表达与临床病理及预后的关系，进一步判断NRP-1在胃癌预后中的影响。

1资料与方法

1.1一般资料收集河北联合大学附属医院2005年1月至2010年12月行胃癌手术的168例患者(所有患者术前均未接受肿瘤相关治疗,术后均未行放疗、二次手术及生物免疫治疗)的临床病理资料，包括患者性别、年龄、发病部位、肿瘤大小、细胞分化程度、浸润深度、区域淋巴结转移情况及是否行围术期化疗,并对上述患者行电话、书信随访。观察终点为总生存期(overall survival,OS)，定义为确诊胃癌时间至最后因癌肿引起死亡的时间。到随访截止时间2014年12月30日，168例患者中，6例失去联系方式，12例死于其他疾病。168例胃癌病例中，男101例，女67例。年龄28～82岁，中位年龄54岁，60岁以下者98例，60岁及以上者70例。肿瘤原发部位：上部58例，中部72例，下部38例。原发肿瘤最大直径大于5 cm者116例，小于或等于5 cm者52例。肿瘤细胞分化程度：高分化32例，中分化42例，低分化94例。肿瘤浸润深度：侵及黏膜及黏膜下者19例，侵及肌层者57例，侵及浆膜及浆膜外者92例。无区域淋巴结转移者26例，淋巴结转移1～7个者95例，大于7个者47例。行围术期化疗者104例，未行者64例。采用美国癌症联合会标准(第7版)对病理行TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期34例，Ⅲ期107例。

1.2切片来源及处理收集上述168例患者的术后癌组织及相对正常组织(距离瘤体5 cm以上[7])。各取组织标本经脱水，甲醛固定，二甲苯透明，蜡块包埋，5 μm每层连续切片，用于免疫组化检测NRP-1在胃癌组织中的表达。病理标本及临床资料的收集均由医学伦理委员会讨论通过。

1.3仪器与试剂免疫组化试剂盒及二抗购于北京中杉金桥公司，兔抗人NPR-1单克隆抗体购于巴傲德生物公司。主要仪器有光学显微镜等。

1.4实验方法采用免疫组化染色法检测168例胃癌组织中NRP-1 的表达。实验均严格按照说明操作，采用PBS液为一抗行阴性对照实验。

1.5免疫组化结果判定参照文献[8]中的方法，对NRP-1的表达以阳性细胞百分率和染色强度得分总和进行判定。随机选取5个高倍镜视野(×400)：(1)阳性细胞数目低于5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分。(2)无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项相加，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中等阳性(++)，5～6分评为强阳性(+++)。两项相加大于或等于3分为高表达，<3分为低表达。

1.6统计学处理采用SPSS17.0软件进行数据处理。两组间及多组间非等级资料差异采用χ2检验；多组间等级资料的比较，采用Mann-Whitney U法；生存分析采用Kaplan-Meier法，组间差异采用log-rank法检验；采用COX比例风险回归模型评估影响预后因子的独立性。检验水准α=0.05(双侧)。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1胃癌组织中NRP-1蛋白水平的表达NRP-1表达于胃癌癌细胞的细胞质，染色为淡黄色至棕褐色为阳性表达，无特异染色者为阴性(图1)。168例胃癌组织中，112例免疫组化结果评定为高表达，比率为66.7%；相对正常组织中，14例高表达，比率为8.33%，胃癌组织中NRP-1的阳性表达高于相对正常组织(χ2=121.956,P=0.000)。

A：正常组织中NRP-1的阳性表达;B：高分化腺癌中NRP-1的阳性表达;C：低分化腺癌组织中NRP-1的阳性表达;D:PBS代替一抗的阴性对照。

图1胃癌组织及相对正常组织中NRP-1免疫组化染色结果

2.2胃癌组织中NRP-1的蛋白表达水平与临床病理特征之间的关系将168例患者临床病理资料与NRP-1表达情况进行统计学分析，发现NRP-1的蛋白表达水平与肿瘤大小、细胞分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄及发病部位无关(P>0.05)，见表1。

2.3胃癌组织NRP-1的表达与预后的关系

2.3.1Kaplan-Meier法评定NRP-1的表达与胃癌患者预后的关系168例胃癌患者的中位生存期为37个月，NRP-1低表达的患者中位生存期64个月，NRP-1高表达的患者中位生存期为28个月，log-rank检验表明组间差异具有统计学意义(χ2=29.150,P=0.000)，见图2。

2.3.2COX多因素分析本实验组建立COX比例风险模型，纳入的临床病理因素包括性别、年龄、发病部位、肿瘤大小、细胞分化程度、浸润深度、淋巴结转移、NRP-1的表达、TNM分期、是否行围术期化疗。进行多因素分析表明，TNM分期(95%CI 4.238～16.704，P=0.000)、淋巴结转移(95%CI 2.046～4.767，P=0.000)、肿瘤浸润深度(95%CI 1.001～2.027，P=0.049)、NRP-1的表达水平(95%CI 1.006～1.989，P=0.046)、围术期化疗(95%CI 0.390～0.939，P=0.025)是影响本组胃癌患者预后的独立危险因素。性别、年龄、发病部位、肿瘤大小、细胞分化程度均不是影响本组胃癌患者预后的独立危险因素(P>0.05)，见表2。

表1　胃癌组织中NRP-1的表达与临床病理特征之间的关系

发病部位*：将胃的大、小弯等分3份，连接其对应点，上1/3为上部，中1/3为中部，下1/3为下部。

图2　NRP-1的表达与胃癌患者生存的关系

表2　168例胃癌患者COX比例风险模型多因素分析结果

3讨论

多项研究已经证明NRP-1表达于多种恶性肿瘤细胞以及肿瘤血管内皮细胞[9]，如前列腺癌[10]、乳腺癌[11]、结直肠癌[12-13]、肝癌[14]等。NRP-1的表达在癌组织较为显著，在癌旁及正常组织表达水平下降或不表达[15]。NRP-1作为VEGF的受体之一与VEGF-165结合，促进肿瘤血管的生成及肿瘤的增殖，从而参与肿瘤的生长、侵袭及转移[16]。

本研究通过免疫组化方法检测胃癌组织中NRP-1蛋白表达水平，同时分析相关的临床病理数据，发现NRP-1的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、细胞分化程度相关，与既往的报道基本一致[17-18]，表明NRP-1与胃癌的发生及发展过程相关。随着肿瘤的直径增大，胃周区域淋巴结转移的增多，NRP-1的表达水平增高(P<0.05)，表明NRP-1可能参与了胃癌细胞的增殖、侵袭及转移；随着临床TNM分期的进展，NRP-1的表达发生变化(P<0.05)，说明NRP-1的表达与胃癌的恶性行为相关。

既往研究中曾证明，NRP-1和恶性肿瘤的预后有关，主要通过影响肿瘤的侵袭转移能力及细胞敏感性影响预后生存[19-20]，可能成为肿瘤治疗的新型靶点。Cheng等[21]应用实时荧光定量聚合酶链反应及免疫组化法检测膀胱癌中的NRP-1的基因水平及蛋白水平的表达，经多因素分析得出NRP-1的表达是影响膀胱癌预后的独立因素。Osada等[22]也提出NRP-1的高表达提示神经胶质瘤的预后不良，且NRP-1的表达比VEGF的表达更能促进神经胶质瘤的生长及转移。本研究发现胃癌细胞中NRP-1蛋白水平高表达的患者中位生存期28个月，而低表达的患者中位生存期64个月，提示NRP-1的高表达者预后不良。本研究中建立的COX比例风险模型多因素分析显示TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润深度、围术期化疗为影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)，与既往研究基本一致[23-24]。本研究观察到本组胃癌患者中NRP-1的表达是影响胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)，提示NRP-1的高表达水平与胃癌的临床转归呈负相关。

综上所述，笔者认为NRP-1的表达与胃癌的部分临床及病理特点相关，有望成为判断预后的观察指标之一，且可能成为胃癌药物治疗的新型靶点。但本研究仅应用免疫组化方法对NRP-1的蛋白水平进行分析，其基因学及分子影响机制尚不完全明确，有待进一步研究。

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Expression of NRP-1 in gastric cancer tissue and its correlation with clinicopathological characteristics and prognosis*

Xu Weiguo1,Yang Shaojun1,Wang Yupeng2,Liu Yun3,Zhang Shiwei4,Xu Hong5,Jia Chunliang6,Sun Hong7,Liu Heliang5

(1.Department of Oncologic Surgery,Affiliated Hospital of Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China; 2.Department of oncology,Tianjin Beichen Hospital,Tianjin 300400,China; 3.Department of Internal Medicine,Langfang Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Langfang,Hebei 065000,China;4.Department of Oncologic Surgery,Fuyang Municipal People′s Hospital,Hangzhou,Zhejiang 310000,China;5.Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China; 6.Department of Gastrointestinal Surgery,Tangshan Municipal People′s Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China; 7.Department of Pathology,Basic Medical College,Hebei United University,Tangshan,Hebei 063000,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the expression of NRP-1 in gastric cancer tissue,to analyze its relationship with clinicopathological features,and to explore its value in judging the prognosis of gastric cancer.MethodsThe clinical pathologic data and prognosis situation in 168 cases of gastric cancer were retrospectively analyzed.The expression of NRP-1 in gastric cancer tissue and normal tissue was detected by the immunohistochemical method.The relationship between the expression of NRP-1 with the clinicopathological features and prognosis was investigated.Whether NRP-1 serving as a reference indicator for judging the prognosis of gastric cancer was evaluated.Results(1) In 168 cases,the NRP-1 expression in gastric cancer tissue was higher than that in normal tissue (66.7% vs. 8.33%,P<0.05).(2) The NRP-1 expression was related with the tumor size,differentiation degree,infiltrative depth,lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05).(3)The median survival time in the patients with high NRP-1 expression was shorter than that in the patients with low NRP-1 expression (P<0.05).(4) The multiple factor analysis by COX proportional hazard model showed that the NRP-1 expression was an independent risk factor for the prognosis of gastric cancer(P<0.05).Conclusion(1)NRP-1 plays an important role in the incidence and development process of gastric cancer and its expression is closely related with the malignant biological behavior of gastric cancer.(2)The high NRP-1 expression prompts poor prognosis.(3)NRP-1 may be expected to be regarded as one of the indexes for judging the biologic behaviors and prognosis of gastric cancer.

[Key words]gastric neoplasms;prognosis;neuropilin-1

doi:论著·临床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.014

* 基金项目：河北省科学技术研究与发展计划(10276115D)。

作者简介：徐卫国(1966-),博士，主任医师，主要从事肿瘤临床与基础方面的研究。

[中图分类号]R735.2

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)08-1049-04

(收稿日期：2015-09-17修回日期：2016-01-12)