固相萃取—高效液相色谱法测定大豆油中维生素K1含量

徐超　周波　王晓红

摘要：选用SPE硅胶柱对样品进行净化处理，分离提取大豆油中的维生素K1，运用灵敏、准确的高效液相色谱法测定样品中维生素K1。试验结果表明：SPE硅胶柱固相萃取法样品分离效果好、结果准确，适用于测定不同种类的大豆油中维生素K1含量。

关键词：固相萃取（SPE）；HPLC；维生素K1；大豆油

中图分类号：R151.3；O657.7 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2016）01-0053-04

维生素K为人体必需的脂溶性维生素，其中人体维生素K1主要来源于绿叶蔬菜（如菠菜、甘蓝、莴苣等）、大豆及其制品。随着对维生素K生理功能研究的不断深入，发现其具有促进凝血、参与骨骼代谢、维持心血管健康等诸多功能。

近年来，国内外研究人员对食物中维生素K1分析测定日益关注。在食品中维生素K1检测方法中，高效液相色谱法（HPLC）因具有灵敏、精密度高、分离效果好、样品处理简单、分析速度快等优点而受到广泛应用。我国已制定蔬菜和乳制品中维生素K1含量的测定方法，但由于缺乏良好的提取和分析方法，国内尚无测定大豆油中维生素K1的标准方法，有关大豆及大豆制品中维生素K1的研究报道也较少。近年来，在色谱分析样品前处理中，固相萃取（Solid Phase Extraction， SPE）成为重要的方法之一，越来越多的国内研究者使用SPE进行色谱分析食品样品的前处理。测定大豆油中维生素K1含量的关键是如何进行分离提取，去除各种干扰物质并避免维生素K1破坏。本研究选用SPE硅胶柱对样品进行净化处理，分离提取大豆油中的维生素K1，运用灵敏、准确的高效液相色谱法测定样品中维生素K1。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

UV1201紫外-可见检测器、AS1201自动进样器、RO1201溶剂管理器、P1201高压恒流泵、EC2006色谱数据处理系统（大连依利特公司）；Laborota 4001旋转蒸发仪；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵；Eppendorf AG5305隔膜真空泵；SC-2546型低速离心机；G-560E漩涡振荡器；SPE硅胶柱（6 mL，1 g）。

正己烷（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、维生素K1标准品（纯度>99%）购自美国Sigma公司；乙醚（分析纯）、正己烷（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 测定方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μL）；柱温：30 ℃；流动相：V（甲醇）︰V（正己烷）=98︰2；检测波长：248 nm；进样量：20 μL；流速：1.5 mL/min。

1.2.2 标准溶液的制备 准确称取维生素K1标准品0.1 g（精确至0.001 g），用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中摇匀，得1 mg/mL维生素K1标准储备液。

1.2.3 样品提取与净化 所有操作在避光室内微弱黄光灯下进行。

取0.1 g油样（精确至0.001 g）溶于5 mL正己烷，剧烈震荡5 min，离心5 min（3 000 r/min），取4.5 mL上清液，待净化。

将SPE硅胶柱（6 mL，1 g，Agilent）分别用8 mL正己烷︰乙醚=97︰3和8 mL正己烷将SPE柱活化后，提取液以1.0 mL/min流速过柱；用8 mL正己烷以1.0 mL/min流速淋洗小柱，最后分5次加入20 mL正己烷︰乙醚=97︰3溶液洗脱，收集洗脱液后浓缩吹干；用5 mL正己烷溶解残渣，转移至试管低温浓缩30 min，加1 mL正己烷定容离心5 min，经0.45 μm滤膜过滤后上机分析。

1.2.4 测定方法 吸取上述样品溶液与标准品溶液分别注入高效液相色谱仪，测得色谱峰面积，以外标法计算样品中的维生素K1含量。

2 结果与分析

2.1 样品预处理方法优化

脂溶性维生素K1在大豆油中含量丰富，如何避免维生素K1破坏并去除干扰物质是分离提取的关键。GB 5413.10-2010将婴幼儿乳制品中的脂肪酶解皂化后提取维生素K1，但维生素K1遇碱易分解，皂化处理使测定结果降低。赵丹霞等采用溶剂萃取提取植物油中的维生素K1，方法简单，但是样品不经净化或净化不完全，共同洗脱下的干扰物质如维生素A、维生素D、维生素E会影响HPLC的分离效果。固相萃取法比溶剂萃取法使用的溶剂更少，操作过程也相对简单，提取和净化同步完成。GB/T5009.158-2003测定蔬菜中维生素K1选用氧化铝做色谱柱，避免使用氧化铝可能造成的维生素K1分解现象。对样品进行净化处理前要先用失活的磷酸盐处理氧化铝，前处理时间长且处理过程复杂。Kamao等使用SPE硅胶柱净化处理油脂类食品，再进行HPLC分析，SPE硅胶柱体积小，对样品的富集和净化效果好。因此，对方法进行改进后采用硅胶柱固相萃取法净化大豆油样品，标准品和样品提取与净化后的HPLC分析图谱分别见图1和图2。

由图1和图2可以看出，处理后的样品分析图谱基线稳定，保留时间附近的杂质被有效去除，干扰较少。同时，对维生素K1标准品进行回收试验验证，结果显示绝对回收率较高，详见表1。

2.2 样本量大小确定及加样回收率试验

本研究采用SPE硅胶柱（6 mL，1 g，Agilent）柱内硅胶填料容量较小。由于大豆油取样量过大，在载样过程中可能有部分维生素K1不能被吸附，直接影响层析效果，造成回收率偏低。参考上样体积对维生素K1回收的影响，通过比较不同的上样体积，最终确定SPE硅胶柱的最佳上样质量为0.1 g。此时分离效果较好，样品中维生素K1的回收率也较好，结果可靠（详见表2）。

2.3 标准曲线制备

准确吸取维生素K1标准储备液100 μL，用分析纯正己烷溶解定容至5 mL，混匀，得到浓度为20 μg/mL的稀释液。再分取一定体积用正己烷稀释溶解定容，分别配制成含维生素K1 0.125，0.25，0.50，2.50，5.00，

10.00 μg/mL的标准液，上机测定，以维生素K1标准品浓度为横坐标、以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见图3。结果表明，维生素K1在0～10 μg/mL范围内线性关系良好（R2>0.999）。

2.4 最低检测限

将标准工作液依次稀释，以10倍仪器响应值标准偏差与标准曲线斜率的比值计算得到仪器的检测限为0.062 5 μg/mL。

2.5 重复性测定

在较短的间隔时间内，取同一份维生素K1标准样品进行6次测定，结果见表3。此次试验的变异系数为3%，由此可见试验重复性较好。

2.6 溶液稳定性测定

取同一个待测样品分别放置在避光和室内室温暗处（22～25 ℃）0，2，4，6，8 h，取待测样品溶液20 μL在同一色谱条件下进行测定，结果见表4。结果显示，测定样品中维生素K1含量的稳定性较好。

2.7 大豆油样品中维生素K1含量测定

测定29种大豆油中的生素K1平均含量，结果显示未检出至215 μg/100 g，平均140.92±33.99 μg/100 g。由于地理环境、植物种类存在差异，因此需要对测定结果做进一步研究。未检出的样品中可能不含维生素K1或含量较低，未达到本方法的最低检出限。

3 结论与讨论

本方法建立了固相萃取-高效液相色谱法测定大豆油中维生素K1的方法，改变了样品的前处理方法，避免使用皂化处理，减少了维生素K1的损失。利用固相萃取方法净化处理样品，能有效地去除样品中的干扰物质。采用富集和净化效果好的小体积硅胶柱，所获结果准确可靠、重复性良好，适用于测定不同种类的大豆油中维生素K1的含量。