滇杨遗传多样性的SRAP分析

颜璐茜李佳蔓员涛周安佩纵丹李旦辛培尧，4何承忠，4

（1. 西南林业大学 云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，昆明 650224；2. 西南林业大学 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，昆明 650224；3. 西南林业大学 云南生物多样性研究院，昆明 650224；4. 西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，昆明 650224）

滇杨遗传多样性的SRAP分析

颜璐茜1，2李佳蔓1，2员涛1，2周安佩1，2纵丹1，2李旦3辛培尧1，2，4何承忠1，2，4

（1. 西南林业大学 云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，昆明 650224；2. 西南林业大学 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，昆明 650224；3. 西南林业大学 云南生物多样性研究院，昆明 650224；4. 西南林业大学 西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室，昆明 650224）

采用SRAP标记分析滇杨的遗传多样性和遗传结构。用筛选出的7对引物组合分析来自7个居群共208个样本，共扩增得到条带146条，多态性条带73条，多态带百分率为50%。滇杨物种水平上的观测等位基因数（Na）为1.500 0，有效等位基因数（Ne）为1.230 9，Nei’s基因多样性指数（H）与Shannon’s信息指数（I）分别为0.136 6与0.210 0。遗传分化系数（Gst）为0.529 4，基因流（Nm）为0.444 4，表明居群间的遗传变异大于居群内，其基因交流处于中等水平。AMOVA分析也表明居群间的变异占总变异的55.61%。UPGMA、PCoA和Bayesian聚类分析结果一致，均显示丽江与曲靖居群、楚雄与昭通居群的亲缘关系较近。Mantel test结果表明滇杨居群间的遗传距离与地理距离不相关。

滇杨；遗传多样性；遗传结构；SRAP标记

滇杨（Populus yunnanensis Dode）是我国西南地区特有的杨属青杨派树种，分布于云南中部、北部及南部的开远、蒙自和文山，贵州威宁，四川凉山州的美姑、布拖等地，生长于海拔1 300-3 200 m，部分地区可达到3 700 m，多沿山涧河溪生长，在海拔2 000 m以上地带有纯林存在，而在海拔较低地区（<1 900 m）主要以混交林或散生形式存在［1］。由于滇杨具有 生长速度快、耐寒、易无性繁殖、抗叶锈病和叶斑病等优良性状［1，2］，兼有较高的观赏价值［3］，被应用于环境保护、城市绿化并在林业生产中扮演着重要角色［4］，具有独特的培养价值。目前关于滇杨的研究主要集中于生长特性［5-8］及栽培繁育［9-12］方面，通过与美洲黑杨（P. deltoides）、欧洲黑杨（P. nig ra）的种间杂交对其遗传改良做出了尝试［13，14］。但有关其分布区域内的遗传多样性研究还未见报道。

在用于分析植物遗传多样性及种质资源的多种分子标记中，SRA P（Sequence-Related Amplified Polymorphism）针对开放阅读框进行标记，在分析种间、种内杂交调查基因多态性与发现新的变异位点等方面有不可估量的价值［15］。该方法已被应用于遗传多样性分析［16］、遗传图谱构建［17］及差异表达基因分离［18］等实验研究。杨树SRAP标记体系的建立和优化 已表明SRAP标记是一种适于杨树遗传多样性研究的分子标记技术［19，20］。基于此，本研究采用SRAP标记分析采集于四川省凉山州、云南省丽江市、曲 靖市、昆明市、大理市、楚雄市和昭通市7个滇杨居群的208个样本，探讨滇杨遗传多样性与遗传结构，以期为其种质资源的保护、开发和利用提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以行政区划的地级市（自治州）为居群单位，按照随机取样的原则，从四川省凉山州、云南省丽江市、曲靖市、昆明市、大理市、楚雄市和昭通市共计7个滇杨居群中选取样株，样株间相隔100 m以上，采集嫩叶用硅胶干燥，带回实验室保存备用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和SRAP分析 干燥后的叶片用冷冻混合球磨仪进行研磨，采用改良的SDS法依照标准酚/氯仿流程［21］提取分析样本基因组DNA，利用0.8%的琼脂糖凝 胶电泳和核酸蛋白检测仪共同检测基因组DNA的纯度和浓度。

1.2.2 SRAP分析 根据SRAP引物设计原理［22，23］，在已有标准引物序列的基础上自行设计正反引物各15条，共计225对引物组合。从中筛选出重复性好、多态性高、分辨率高的7对引物组合用于后续实验。

PCR反 应 体 系（10 μL）：10×buffer（ 含25 mmol/L Mg2+）1 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.7 μL，正反引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.2 μL，DNA模板2.5 μL，ddH2O补足（2.6 μL）至10 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；前5个循环，94℃变性50 s，36℃退火50 s，72℃延伸90 s；后30个循环，94℃变性50 s，50℃退火50 s，72℃延伸90 s；72℃延伸10 min。

PCR扩增产物经94℃变性10 min后在6%变性聚丙烯酰胺上进行电泳分离，恒定功率为70 W，电泳产物采用银染法［24］进行谱带的显色反应。

1.2.3 数据分析 根据电泳图谱中相同片段位置谱带的“有”与“无”构建0/1矩阵。采用POPGENE version 1.32软件［25］计算滇杨每个居群的多态性条带数、多态带百分率、观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon’s信息指数（I），以及滇杨总遗传多样性（Ht）、居群内遗传多样性（Hs）、居群间遗传分化系数（Gst）、基因流（Nm）、Nei’s遗传距离和遗传相似系数。应用AMOVA 1.55软件［26］进行分子变异方差分析。利用GENALEX v6.41软件［27］对滇杨居群地理距离和遗传距离的相关性进行Mantel test分析，依据遗传距离进行主坐标轴分析（PCoA）。在NTSYS2.1e软件［28］中运用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行基于遗传相似系数的聚类分析。采用Structure 2.3.1［29］进行Bayesian聚类分析，选择混合模型（Admixture model）和相关等位基因模型（Correlated alleles frequencies model），设定参数“burn-in-period”为104，MCMC重复运算105次，K值检测范围设定为1-11，每个K值独立运行20次。应用Clumpp 1.1.2［30］对数据进行整理和分析，参照Evanno等［31］的方法确定最佳K值，利用Distruct 1.1［32］绘制Bayesian聚类图。

2 结果

2.1 SRAP多态性分析

筛选出的7对引物组合共扩增出条带146条，多态性条带73条，多态带百分率为50%。引物组合Me3/Em9获得的总条带数（32条）、多态性条带数（19条）、多态带百分率（59.4%）均最高，引物组合Me3/Em8的最少，总条带数、多态性条带数和多态带百分率分别为14条、3条和21.4%（图1和表1）。

图1 PCR扩增产物的6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染图

表1 SRAP引物及其扩增结果

2.2 滇杨居群的遗传多样性和遗传结构

7个居群的遗传多样性（表2）显示，平均多态带百分率为22.70%，平均观测等位基因数为1.227 0，平均有效等位基因数为1.107 6，Nei’s基因多样性指数与Shannon’s信息指数分别为0.064 4与0.098 9。其中丽江居群的有效等位基因数（1.148 2）、Nei’s基因多样性指数（0.088 7）和Shannon’s信息指数（0.134 8）均最高，略高于曲靖居群（Ne=1.134 3，H=0.081 2，I=0.125 7）；而多态带百分率与观测等位基因数则是曲靖居群最高，分别为30.82%和1. 308 2；昭通居群的多态带百分率（14.38%）、观测等位基因数（1.143 8）、有效等位基因数（1.070 1）、Nei’s基因多样性指数（0.042 6）和Shannon’s信息指数（0.065 2）均最低。

滇杨总遗传多样性（Ht）为0.136 9，居群内平均遗传多样性（Hs）为0.064 4，7个居群总遗传分化系数（Gst）为0.529 4，基因流（Nm）为0.444 4，表明居群间的遗传变异大于居群内，其基因交流处于中等水平。分子方差分析结果（表3）显示，居群间的变异分量为6.71，占总变异的55.61%，差异达极显著水平（P<0.001）。而居群内个体的变异分量为5.36，占总变异的44.39%，低于居群间的变异程度。由此可知，滇杨的遗传差异主要来自于不同居群之间。

表2 滇杨7个居群的遗传多样性

表3 滇杨7个居群的分子方差分析

两两居群间的最高遗传分化系数出现在昆明与凉山居群之间，其Gst值为0.523 3；其次为昭通与凉山居群Gst值为0.509 2；而楚雄与昭通居群（Nm=1.987 8）、丽江与曲靖居群（Nm=1.704 9）基因交流最多，其Nm值均大于1（表4）。经Mantel检验，滇杨7个居群的地理距离与遗传距离的相关系数为-0.157（P=0.241），表明两者间无相关性（图2）。

表4 滇杨居群间的遗传分化系数（Gst）和基因流（Nm）

图2 滇杨7个居群的地理距离和遗传距离相关性

2.3 聚类分析

居群间的平均遗传相似系数为0.909 7，变幅为0.876 2-0.971 6，楚雄与昭通居群之间遗传相似系数最高，为0.971 6，其次为丽江与曲靖居群（0.945 6），凉山与昆明居群最低，为0.876 2。如图3所示，在阈值为0.91时可分为3个组，凉山居群为第1组，昆明与大理居群构成第2组，其余4个居群为第3组。主坐标轴分析（PCoA）中，前3个特征向量的累计贡献率为72%，基于PCoA的结果与UPGMA聚类结果基本一致，昭通与楚雄居群聚类，丽江与曲靖居群聚类，而凉山、大理、昆明3个居群相对分散（图4）。

图3 滇杨7个居群之间的UPGMA聚类图

根据Evanno等［31］的方法确定最佳K值，滇杨7个居群的Delta K在K=2时最大（3.47），K=4（2.71）和K=6（1.97）时次之，分别对其进行聚类（图5），3种K值的聚类结果基本一致，也与PCoA和UPGMA的聚类结果类似。如当K=4时，凉山居群单独构成第1组，丽江和曲靖居群为第2组，昆明和大理居群组成第3组，昭通和楚雄居群被分到第4组。

图4 滇杨7个居群的主坐标轴分析

图5 滇杨7个居群的Bayesian分析

3 讨论

SRAP标记多态性高，产率中等，重复性好，在基因组中分布均匀；较易对扩增得到的目的片段进行测序；操作简单，其正向引物可以与反向引物两两搭配组合，用少量的引物可以得到多个引物对，引物的使用效率高，可降低实验成本，研究表明，SRAP标记比AFLP、RAPD等标记方式更能体现 表型的多样性及 进化史［33，34］，其聚类结果要比AFLP更相似于形态学分析结果［19］。SRAP标记已广泛应用于遗传多样性分析，但在不同树种中扩增得到 的多态性各异，如 紫铆（Butea monosperma）、桑树（Morus）和石榴（Punica granatum）的多态带百分率分别为91.90%、78.41%和53.20%［35-37］。而SRAP标记在杨树遗传变异分析中的应用较少，还处于起步阶段，郭丽琴等［19］、陈罡等［20］通过建立和优化SRAP-PCR体系，为SRAP标记在杨树中的应用奠定了科学基础，随后郭娟等［38］对比了SRAP和EST-SSR标记在美洲黑杨品种间遗传差异分析中的结果，并认为SRAP标记更适合用于杨树亲缘关系较近材料的分析。

遗传多样性是生物长期生存、进化和适应的结果［39］，研究遗传多样性，有利于合理保存和利用基因资源［40］。在滇杨的研究中，纵丹等［41］采用AFLP分析52株滇杨优树的遗传多样性，其多态带百分率为64.52%，李里等［42］同样用AFLP标记对采集于四川省和云南省的56株滇杨优树的遗传多样性进行了分析，多态带百分率为59.25%。本研究中，滇杨的SRAP多态 带百分率为50%，略低于AFLP分析结果。与杨属其他树种相比，辽宁杨为95.3%（SRAP）［20］，美洲黑杨为72.8%（SRAP）［43］，毛白杨为65.17%（AFLP）［44］，毛果杨为58%（AFLP）［45］，大青杨为52%（RAPD）［46］，胡杨为49.2%（RAPD）［47］，表明滇杨的遗传多样性水平中等。同时，由于无性繁殖群体与近缘有性繁殖种相比遗传多样性较低［39］，滇杨居群的Nei’s基因多样性指数与Shannon’s信息指数（H=0.1366，I=0.2 100）均低于无性繁殖与有性繁殖同时存在的苦杨（P. laurifoli，SSR，H=0.3924，I=0.9185）和欧洲黑杨（SSR，H=0.2187，I=0.3348）［48］（表5）。

表5 分子标记揭示的杨属树种多态带百分率

遗传分化系数Gst为居群间变异与总变异的比值，Nm为居群间和居群内的遗传物质交流［49］，二者均为分析居群遗传结构的重要指标。Govindajaru认为，Nm>1则基因交流程度高，0.250

滇杨主要被用作行道树或民间自发地用于四旁零散种植，栽种地域内的百姓根据自己的判断在有限范围内选取本地优良单株采枝扦插繁殖［1］，促使滇杨在选取一定种源后仅在小范围内传播，缺乏居群间的交流。同时，不科学的人工种植会造成遗传上的高度同质化［57］，降低滇杨的遗传多样性。因此，保护滇杨的遗传多样性，构建核心种质并完善遗传改良策略，是开发滇杨资源的必要环节。

4 结论

本研究利用7对SRAP引物组合从7个不同居群的208个滇杨样本中共扩增出146条条带，多态带百分率为50%。滇杨居群间的遗传分化系数（Gst）为0.529 4，基因流（Nm）为0.444 4，AMOVA分析结果表明居群间的变异占总变异的55.61%，表明滇杨的遗传变异主要存在于居群间，居群间基因交流处于中等水平。UPGMA、PCoA和Bayesian聚类分析结果均显示丽江与曲靖居群、楚雄与昭通居群的亲缘关系较近，Man tel test结果表明滇杨居群间的遗传距离与地理距离不相关。

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（责任编辑 马鑫）

Genetic Diversity Analysis of Populus yunnanensis by SRAP Markers

YAN Lu-xi1，2LI Jia-man1，2YUAN Tao1，2ZHOU An-pei1，2ZONG Dan1，2LI Dan3XIN Pei-yao1，2，4HE Cheng-zhong1，2，4
（1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming 650224；2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China，State Forestry Administration，Southwest Forestry University，Kunming 650224；3. Yunnan Academy of Biodiversity，Southwest Forestry University，Kunming 650224；4. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China，Ministry of Education，Southwest Forestry University，Kunming 650224）

To figure out the genetic diversity and genetic structure of Populus yunnanensis，208 samples from 7 populations were analyzed by sequence-related amplified polymorphism（SRAP）markers. With selected 7 pairs of primers，146 bands were obtained，in which 73 fragments（50%）were polymorphic. The values at the species level were 1.500 0 for observed alleles number（Na），1.230 9 for effective alleles number（Ne），0.136 6 for Nei’s genetic diversity index（H），and 0.210 0 for Shannon’s information index（I）. The genetic differentiation coefficient（Gst）was 0.529 4 and gene flow（Nm）was 0.444 4 and on intermediate stage，indicating that genetic variability of P. yunnanensis mainly took place among populations. Similarly，AMOVA showed that the genetic diversity among populations accounted for 55.61% of total. Clustering analysis by UPGMA，PCoA and Bayesian constantly revealed that population Lijiang and Qujing were in close relationship，and the same for population Chuxiong and Zhaotong. In addition，no correlation between the genetic distance and geographical distance was found by Mantel Test.

Populus yunnanensis；genetic diversity；genetic structure；SRAP marker

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.021

2015-04-22

国家林业公益性行业专项（201104076），国家自然科学基金项目（31360184，31460205），云南省中青年学术与技术带头人后备人才培养基金项目（2012HB021），西南林业大学大学生创新基金项目（C14113）

颜璐茜，女，硕士研究生，研究方向：植物生物技术；E-mail：695253285@qq.com

何承忠，男，教授，博士生导师，研究方向：林木遗传育种与分子生物学；E-mail：hcz70@163.com